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[研究背景]当病原体感染宿主细胞时,被感染的细胞发生程序性坏死是宿主防御的重要机制之一。细胞程序性坏死(Necroptosis)是一种受调控的细胞坏死方式,主要由受体相互作用激酶 3(Receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3)及其底物蛋白——混合谱系激酶结构域蛋白(Mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)的活化介导发生的。人单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus 1,HSV-1)是一种常见的致病性疱疹感染病毒,主要引发口腔和唇等部位感染如疱疹性龈口炎(Herpetic gingivostomatitis),严重的还会引起脑炎(Encephalitis)等。当HSV-1病毒感染小鼠细胞时,HSV-1病毒蛋白核糖核苷酸还原酶大亚基(ICP6)能够通过RHIM结构域结合鼠源RIPK3,进一步激活下游的底物蛋白MLKL,启动宿主细胞发生程序性细胞坏死,病毒得以被宿主细胞清除。然而,当HSV-1病毒感染天然宿主人源细胞时,ICP6依然可以与人源RIPK3结合,但却抑制了人源RIPK3的活化,从而逃逸了天然宿主细胞的程序性坏死应答,病毒得以在宿主细胞内增殖。因此,HSV-1病毒蛋白ICP6在人源和鼠源细胞中分别发挥抑制和促进细胞程序性坏死的作用。目前,ICP6蛋白在天然宿主人源细胞中负调控细胞程序性坏死的机制有待阐明,此机制的解答有望为揭示HSV-1病毒的致病机理提供新的思路。[研究目的]旨在运用分子生物学、细胞生物学等研究方法与技术和严谨的实验设计,以探究在HSV-1病毒感染过程中,HSV-1病毒蛋白ICP6对天然宿主细胞启动的程序性坏死的负调控机制,进一步阐明HSV-1病毒在生物进化过程中获得的抵抗宿主防御的能力。[研究方法](1)为了探寻HSV-1病毒蛋白ICP6对人源细胞程序性坏死的负调控机制,我们利用将HSV-1病毒蛋白ICP6分别与人源RIPK3和鼠源RIPK3共转染以检测ICP6是否对人源RIPK3和鼠源RIPK3存在不同修饰,结果发现了ICP6诱导人源RIPK3发生特异性的修饰。(2)利用蛋白纯化技术和磷酸化修饰检测体系,进一步判断ICP6诱导人源RIPK3的修饰方式。(3)利用分子克隆技术构建不同程度截短的RIPK3表达质粒,进一步确定ICP6诱导人源RIPK3发生修饰的区间。(4)通过点突变技术确定RIPK3磷酸化修饰位点,将可能发生修饰的位点都突变成丙氨酸(A)(模拟丧失磷酸化功能),然后通过共转染体系进行功能验证。(5)通过慢病毒感染包装体系,构建RIPK3修饰位点的丧失或激活的突变体,然后探究其对程序性坏死的影响。[研究结果](1)在共转染体系中,发现HSV-1病毒蛋白ICP6诱导人源RIPK3发生修饰作用,并且该修饰在鼠源细胞株中不存在。(2)ICP6介导的人源RIPK3修饰依赖于RIPK3自身的RHIM结构域,而不依赖于其激酶活性及其坏死磷酸化位点。(3)磷酸酶处理实验表明ICP6介导的人源RIPK3修饰是一种磷酸化修饰。(4)HSV-1病毒蛋白ICP6诱导的人源RIPK3的修饰主要发生在其C端,即修饰位点在氨基酸431-518位之间。(5)ICP6介导的人源RIPK3修饰主要发生于RIPK3第467位的苏氨酸与第513位的酪氨酸。(6)RIPK3第467位的苏氨酸变成丙氨酸(A)之后,能够促进TNF诱导的细胞程序性坏死以及增强HeLa细胞对HSV-1感染诱导的细胞坏死的敏感性。对第467位苏氨酸突变成天冬氨酸(D)模拟蛋白发生磷酸化后,能够抑制TNF诱导的细胞程序性坏死。(7)RIPK3第513位的酪氨酸突变成天冬氨酸(D)之后,也能够抑制TNF诱导的细胞程序性坏死。[结论]综上所述,我们发现HSV-1病毒蛋白ICP6能够诱导人源RIPK3发生特异性的磷酸化修饰;ICP6能够诱导人源RIPK3的第467位的苏氨酸与第513位的酪氨酸发生磷酸化修饰;入源RIPK3磷酸化修饰位点的第467位苏氨酸与第513位的酪氨酸对于细胞程序性坏死起着负调控作用。