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目的根据IRE1组成的四个不同结构域,分别构建IRE1全长、缺失体及截短型真核表达载体;构建靶向IRE1的RNA干扰质粒pSUPER-IRE1,运用MTT、细胞计数、BrdU、流式细胞术等方法研究肝癌细胞在ERS时,IRE1与细胞增殖及凋亡的关系。方法(1)使用Oligo Engine软件设计两条IRE1 siRNA序列,合成两对干扰序列,分别插入到空载体pSUPER中,构建靶向IRE1的两条干扰质粒pS1-IRE1和pS2-IRE1。将构建好的干扰质粒分别转染到HeLa细胞和HepG2细胞中,RT-PCR方法分别检测pS1-IRE1和pS2-IRE1转染前后IRE1转录的变化;免疫印迹分别检测pS1-IRE1和pS2-IRE1转染前后IRE1蛋白表达的变化。(2)应用PCR重组技术,以pCMV-IRE1为模板分别扩增IRE1全长、缺失体和截短型序列,利用DNA重组技术将片段定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,经酶切及测序鉴定后,免疫印迹检测各重组载体在细胞中的表达,并利用SWISS-MODEL在线软件预测IRE1各组成结构域的蛋白结构;以免疫荧光技术检测IRE1在不同细胞中的定位分布。(3)以内质网应激诱导剂衣霉素Tm建立ERS细胞模型,将构建好的各重组质粒和空质粒分别转染肝癌细胞SMMC-7721,运用MTT、细胞计数以及BrdU检测ERS时IRE1与细胞增殖的关系。(4)Tm刺激细胞建立细胞应激模型,运用流式细胞术检测转染上述各组重组质粒后细胞周期分布及凋亡率,研究ERS时IRE1及各结构域与细胞凋亡的关系。结果(1)成功构建IRE1的干扰质粒pS1、pS2;转染HeLa和HepG2细胞后IRE1的mRNA水平和蛋白水平与对照组相比均有明显降低,mRNA水平pS1抑制率分别是69.67%和57.14%,pS2抑制率分别是67.85%和55.79%;蛋白水平pS1抑制率分别为pS1 71.14%和54.65%,pS2抑制率为67.26%和44.62% ,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)成功构建真核表达载体pIRE1、pD-Kinase、pD-RNase、pNLD、pKinase、pR+K和pRNase,转染HEK293细胞后,均能在细胞中检测到正确表达,免疫荧光检测不同细胞中IRE1均定位分布于细胞质中。(3)ERS状态下,过表达IRE1对于SMMC-7721细胞增殖具有促进作用;而转染pS1-IRE1和pS2-IRE1干扰质粒、IRE1缺失体真核载体pD-Kinase和pD-RNase以及IRE1各截短型真核载体pNLD、pKinase、pR+K和pRNase,对于SMMC-7721细胞的增殖均有抑制作用,各组差异均具有统计学意义(P<0.05)。其中IRE1组成结构域Kinase和RNase与细胞增殖作用密切相关,而IRE1的每一个组成结构域对细胞增殖的作用是不同的。(4)ERS状态下,过表达IRE1明显抑制SMMC-7721细胞的凋亡;而转染pS1-IRE1和pS2-IRE1干扰质粒、IRE1缺失体真核载体pD-Kinase和pD-RNase以及IRE1各截短型真核载体pNLD、pKinase、pR+K和pRNase,对于SMMC-7721细胞的凋亡均有促进作用,各组差异均具有统计学意义(P<0.05)。其中IRE1组成结构域Kinase和RNase与细胞凋亡密切相关,而IRE1的每一个组成结构域对细胞凋亡的作用是不同的。结论成功构建IRE1全长真核载体pIRE1、IRE1缺失体真核载体pD-Kinase和pD-RNase及IRE1截短型真核载体pNLD、pKinase、pR+K、pRNase和pS1-IRE1和pS2-IRE1干扰质粒;ERS时,过表达IRE1促进细胞增殖,抑制细胞凋亡;IRE1组成结构域Kinase和RNase与细胞增殖及凋亡密切相关。