慢性胰腺炎(Chronic pancreatitis,CP)是由各种因素引起的一种胰腺组织慢性炎症-纤维化性疾病,其病理特征为腺泡萎缩、腺泡导管化生、炎细胞浸润、间质纤维化、胰管扩张/扭曲/狭窄和组织钙化。CP患者的主要临床表现为腹痛可伴腰背痛、脂肪泻、血糖升高和营养不良。小部分CP患者甚至可进展成胰腺癌,缩短了预期寿命。临床上治疗CP的主要手段为胰酶替代、体外震波碎石、内镜和外科手术。但是,尚无有效的药物可以逆转胰腺组织的慢性炎症及纤维化进程。因此,迫切需要研究CP的发病机制并寻找有效的治疗药物。胰腺纤维化是CP的重要病理特征之一。胰腺星状细胞(Pancreatic stellate cells,PSCs)在组织纤维化过程中发挥了关键作用。胰腺组织损伤所致的炎症反应激活了PSCs,PSCs活化后分泌大量的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM),ECM沉积在组织间质内引起纤维化,最终导致了胰腺内外分泌功能的减退。此外,慢性炎症反应保证了PSCs的持续激活,加速了组织纤维化。巨噬细胞在慢性炎症反应中发挥了关键作用,不同功能类型的巨噬细胞均促进了CP的发展。吡非尼酮(Pirfenidone,PFD)是一种具有广谱抗纤维化作用的药物,已被FDA批准用于治疗特发性肺纤维化患者。梣酮(Fraxinellone,Frx)是从中草药中提取出来的一种多效性天然产物,具有抗炎、抑制肿瘤等作用。本研究将通过小鼠模型和体外细胞实验来探索PFD和Frx对CP的疗效及其分子作用机制,旨在为CP的临床药物治疗提供实验基础。本研究在C57BL/6雄性小鼠体内反复腹腔注射雨蛙素6周造CP模型,对照组小鼠体内反复腹腔注射生理盐水。治疗药物PFD或Frx从CP造模的第4周开始灌胃,持续约4周。每周监测各组小鼠的体重变化,可见单纯雨蛙素造模组小鼠的体重比对照组小鼠明显下降,而PFD或Frx治疗组小鼠的体重比单纯雨蛙素组小鼠显著增加,这说明PFD和Frx可以改善CP小鼠的体重变化,改善营养状况。小鼠处死后将胰腺组织进行石蜡包埋,切片进行H&E染色、Sirius red染色、Masson’s trichrome染色和IHC染色以评估CP的严重程度。单纯雨蛙素造模组小鼠的胰腺组织切片染色结果显示腺泡萎缩、炎细胞浸润、腺泡导管化生和纤维化形成,而对照组小鼠的胰腺切片染色结果显示正常的组织结构。PFD或Frx治疗组小鼠的胰腺切片染色结果显示组织损害程度明显减轻,CP病理学评分有所改善。此外,本研究提取了小鼠胰腺组织的RNA,进行RT-PCR和q PCR实验,分析了目的基因的转录表达情况。与对照组相比,单纯雨蛙素造模组小鼠胰腺组织内纤维化相关基因(αSMA、FN、Col1α1、TGFβ)和炎症相关基因(F4/80、CD68、TNFα、IL-6、CCL2)的转录表达明显增加,而PFD或Frx治疗可以减少纤维化和炎症相关基因的表达,这为体内实验PFD或Frx的疗效提供了一种解释机制。为进一步探索PFD和Frx的分子作用机制,本研究将进行大量体外实验,主要针对在CP发生发展过程中发挥关键作用的PSCs和巨噬细胞。首先分析PFD或Frx对PSCs活化及ECM合成的影响。本研究通过q PCR实验分析了PSCs活化marker(αSMA)及ECM(FN、Col1α1)的转录表达,并检测纤维化相关细胞因子CTGF和基质金属蛋白酶(MMP2/9)及其抑制剂(TIMP1/2)的转录表达。WB和IF实验分析了fibronectin、collagen和CTGF的蛋白表达。上述实验结果证明PFD和Frx能够抑制PSCs的激活和ECM的合成。为进一步解析PFD抑制PSCs活化的分子机制,本研究进行PSCs的转录组测序分析,找到了药物处理组和对照组之间的差异表达基因并推测出4条细胞信号转导通路与PFD的作用密切相关。随后通过q PCR、WB和IF实验分析了TGF-β/Smad信号通路、Wnt/β-catenin信号通路、JAK/STAT信号通路和Hippo信号通路中的关键组分的表达情况。实验结果显示PFD减少了转录因子Smad2/3的磷酸化,降低了LRP6和GSK3β的磷酸化水平,减少了activeβ-catenin的表达,并下调了靶基因CCND1、c-Myc和LEF1的表达。此外,PFD还能够减少转录因子STAT3的磷酸化,而对YAP的磷酸化无明显影响。上述结果证明PFD通过TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin和JAK/STAT信号通路抑制了PSCs活化与ECM的合成。除了影响PSCs的激活,PFD还可以抑制PSCs的迁移,被细胞划痕实验和Transwell迁移实验所证实。此外,流式细胞实验结果还显示PFD可以增加PSCs的凋亡。对于Frx抑制PSCs活化的分子机制,本研究主要分析了MAPK和GSK3β/β-catenin信号通路。WB实验证明Frx可以降低p38 MAPK和GSK3β的磷酸化水平,减少activeβ-catenin及基因CCND1、c-Myc和LEF1的表达。因此推测Frx通过p38 MAPK/GSK3β/β-catenin信号通路抑制了PSCs活化与ECM的合成。巨噬细胞在胰腺慢性炎症中发挥着关键作用。本研究将进行体外实验分析PFD和Frx对巨噬细胞功能的影响。用LPS刺激巨噬细胞使其发生M1型极化,发挥促炎功能。用IL-4/IL-13刺激巨噬细胞使其发生M2型极化,发挥促纤维化功能。用PFD或Frx分别处理不同功能类型的巨噬细胞。由q PCR实验可知PFD下调了基因i NOS、TNFα和IL-1β的转录表达而没有影响基因CD206、CD301和Arg1。由WB实验可知PFD减少了CD86、i NOS、TNFα和IL-1β的蛋白表达而没有影响CD206、IL-4R、Arg1和TGFβ。此外,WB和IF实验结果显示PFD降低了STAT3的磷酸化水平而没有影响STAT1、IκBα和p65的磷酸化。因此说明PFD抑制巨噬细胞M1型极化,通过STAT3信号发挥抗炎功能,而没有影响巨噬细胞M2型极化。关于Frx对巨噬细胞功能的研究,首先进行了巨噬细胞的转录组测序分析,找到了药物处理组和对照组之间的差异表达基因,推测Frx既影响了巨噬细胞M1型极化,又影响了M2型极化。随后的q PCR和WB实验结果显示Frx下调了M1型、M2型极化相关的基因表达。WB结果还显示Frx可以抑制LPS刺激升高的IκBα和p65的磷酸化水平,而且可以抑制IL-4/IL-13刺激增加的IL-4R的表达。因此证明Frx通过NFκB信号通路抑制巨噬细胞的促炎功能,通过减少IL-4R抑制巨噬细胞的促纤维化功能。此外,用PSCs的上清液刺激巨噬细胞可使其发生M2型极化。q PCR结果显示Frx可以减少PSCs分泌趋化因子CCL2的表达,并下调了巨噬细胞分泌促纤维化因子TGFβ和PDGF的表达,而且可以拮抗PSCs上清液的作用。因此说明Frx还影响了PSCs与巨噬细胞之间的交互作用。综上所述,PFD和Frx可以缓解雨蛙素诱导的小鼠CP,抑制PSCs活化及ECM的合成,并减轻巨噬细胞的促炎促纤维化作用,有希望作为临床药物治疗CP。