论文部分内容阅读
前言发育性髋关节发育不良(developmental displysia of the hip，DDH)是小儿骨科常见的髋关节发育障碍性疾病，发病率1-1.5‰，目前病因不明。以往的研究发现DDH患儿多伴有全身关节松弛，这与髋脱位术中所见松弛薄弱的髋关节囊与圆韧带相符。因此髋关节松弛是导致髋脱位主要因素之一也得到了普便认同。关节过度活动或关节松弛目前认为是一种疾病并已得到儿科及骨科医师的重视，它可发生在单个关节或是全身性的。大多数学者认为它是由基因决定的结缔组织松弛所造成的，特别是对关节囊和韧带的影响。目前已知的3个经典的与基因有关的胶原疾病有：1)马凡氏综合症：是原纤维蛋白基因FIB 1和FIB 2的突变；2)成骨不全：有200多种独立突变发生在COL 1a1和COL1a2；3)Ehlers-Danlos综合症：约有80种突变发生在COL 3a1。因此有许多学者推测DDH可能是一种发生在结缔组织的可遗传的疾病，很可能与某些细胞外基质成分有关，如胶原、弹力纤维等。人类出生时髋臼较浅，股骨头表面为平滑弧线，出生后髋臼不断加深，股骨头弧度加大，髋关节逐渐稳定，而这需要头臼同心的相互作用才能达到。而关节囊和圆韧带则具有保持这种头臼同心位置重要的作用。胶原纤维及小分子蛋白多糖是关节囊和圆韧带的主要成分，并发挥着重要的抗张力生物学作用。以往关于DDH关节囊及圆韧带中胶原纤维的研究有过少量报道但结果迥异，多停留在组织形态水平。本研究以DDH患儿髋关节囊和圆韧带为研究对象，应用免疫组织化学法观察Ⅰ、Ⅲ型胶原在髋关节囊和圆韧带的分布与定位；应用分子生物学检测技术比较Ⅰ、Ⅲ型胶原和两种小分子蛋白多糖(Biglycan和Decorin)在转录水平和(或)蛋白水平的表达差异。试图从分子水平揭示DDH患儿髋关节松弛的机理，是关节松驰导致DDH理论的一次深入探索。材料与方法一、标本采集及处理发育性髋脱位髋关节囊标本33例，来源方式：手术复位中经紧缩后切除的髋关节上方多余关节囊。对照组儿童髋关节囊标本17例。在DDH组选择与对照组性别相同，年龄相近的9例患儿与对照组配对。发育性髋脱位髋关节圆韧带标本20例，来源方式：手术复位中切除的患髋圆韧带。对照组儿童圆韧带标本10例。在DDH组选择与对照组性别相同，年龄相近的6例患儿与对照组配对。剪取标本为多个小组织块：部分置于4％多聚甲醛溶液中室温固定24小时，脱水，透明，石蜡包埋，制成5μm切片；部分置于Eppendorf管中，-80℃深低温保存。二、实验方法及检测指标(一)免疫组织化学法(SABC法)观察Ⅰ、Ⅲ型胶原在DDH患儿髋关节囊及圆韧带中的定位与分布，半定量测定Ⅰ、Ⅲ型胶原含量。(二)髋关节囊及圆韧带中Ⅰ、Ⅲ型胶原和两种小分子蛋白多糖(Biglycan和Decorin)转录水平检测反转录聚合酶链反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)测定COL1a1、COL3a1、Biglycan和Decorin mRNA水平表达。(三)髋关节囊及圆韧带中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白水平检测免疫印迹杂交技术(Western-Blot)检测COL1a1、COL3a1蛋白水平表达。三、统计学处理采用SPSS10.0软件进行统计学分析，p＜0.05视为统计学上显著差异。应用Pearson法进行相关分析，配对比较采用配对T检验。实验结果一、Ⅰ、Ⅲ型胶原的定位、分布与含量(一)关节囊1、Ⅰ型胶原贴近关节侧的滑膜层呈强阳性表达，成纤维细胞及胶原纤维平行滑膜缘排列规整。纤维层阳性表达有所减弱，胶原纤维排列波浪样、多级性，成纤维细胞散布其间。在性别相同，年龄相近的9例配对比较中，纤维层中有阳性表现的成纤维细胞数占总计数成纤维细胞的百分比及胶原染色的灰度值在髋脱位组与对照组间存在显著差异(p＜0.05)2、Ⅲ型胶原仅在DDH组纤维层中出现3例大龄女性患儿阳性反应：2例为成纤维细胞周围出现环绕棕色深染；1例为细胞外基质网状棕色深染。(二)圆韧带1、Ⅰ型胶原贴近外周的圆韧带鞘呈强阳性表达，胶原纤维平行滑膜缘排列规整。内部纤维层阳性表达有所减弱，胶原纤维排列波浪样、多极性，成纤维细胞散布其间。在性别相同，年龄相近的6例配对比较中，纤维层中有阳性表现的成纤维细胞数占总计数成纤维细胞的百分比及胶原染色的灰度值在DDH组与对照组间存在显著差异(p＜0.05)。2、Ⅲ型胶原DDH组与对照组均未见阳性反应。二、Ⅰ、Ⅲ型胶原和两种小分子蛋白多糖(Biglycan和Decorin)mRNA表达差异(一)关节囊COL1a1、COL3a1、Biglycan和Decorin mRNA在DDH组表达较正常对照组降低(p＜0.01)。(二)圆韧带COL1a1、Biglycan和Decorin mRNA在DDH组表达较正常对照组降低(p＜0.01)。COL3a1无显著差异(p＞0.05)。三、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达差异(一)关节囊COL1a1蛋白含量在DDH组较正常对照组降低(p＜0.01)。COL3a1无显著差异(p＞0.05)。(二)圆韧带COL1a1蛋白含量在DDH组较正常对照组降低(p＜0.01)。COL3a1无显著差异(p＞0.05)。结论一、婴儿期至青春期前DDH患儿髋关节囊及圆韧带中旺盛分泌Ⅰ型胶原的成纤维细胞的比例较正常同性同龄儿减小，提示DDH患儿Ⅰ型胶原合成能力下降。二、DDH患儿髋关节囊及圆韧带中Ⅰ型胶原在mRNA及蛋白水平表达较正常同性同龄儿降低，可能是导致DDH患儿髋关节松弛的主要原因。三、DDH患儿髋关节松弛可能与Ⅲ型胶原含量无关。四、双糖链蛋白多糖(Biglycan)和核心蛋白聚糖(Decorin)mRNA在DDH患儿髋关节囊及圆韧带的表达降低，二者很可能参与DDH的髋关节松驰机制。