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动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是动脉壁纤维脂肪病变的形成,其进展缓慢,在出现明显的临床症状前“潜伏期”长,是一种血管炎症性疾病。AS进一步发展,可演变为一列心血管疾病,如心肌梗死、脑卒中、外周动脉疾病等,在世界范围内引起极高的患病率和死亡率。AS常常与血管衰老并存,细胞衰老又是血管衰老的原因之一。有研究证明衰老的内皮细胞出现在动脉粥样硬化的病变部位。内皮细胞衰老引起的内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化发生、发展的病理生理基础。晚期氧化蛋白产物,（advanced oxidative protein products,AOPPs）被认为是一种氧化应激的产物。研究证明,AOPPs会随年龄的增长而逐渐积累,并发现其在动脉粥样硬化患者血清中增高。我们的实验结果证实AOPPs可引起内皮细胞早衰,因此本课题将以AOPPs刺激的内皮细胞作为本研究的衰老细胞模型,探讨内皮细胞衰老发生的内在分子机制。该模型目前未见报道,具备可行性和创新性。衰老的细胞究竟是走向凋亡还是凋亡逃逸,是什么机制决定了衰老细胞的命运?这一命题在学术界引起了争论。目前有关凋亡逃逸的研究大多集中在肿瘤研究领域,但关于内皮细胞的凋亡逃逸目前研究极为少见。由于内皮细胞在体内的更替率低,一旦损伤则增殖修复困难,我们推测,衰老的内皮细胞很可能不是直接凋亡而是逃避凋亡,以衰老的状态长期存活并在体内积累,从而引起血管衰老及功能障碍。因此,明确衰老的内皮细胞会否发生凋亡逃逸并阐明其机制,对AS等衰老相关疾病的防治具有重要意义。以往对细胞衰老的研究,多与端粒酶和Sirt介导的乙酰化水平变化有关。而我们的前期研究发现,p53的SUMO化修饰在衰老的内皮细胞中增高,提示p53的SUMO化可能介导内皮细胞衰老。研究表明,细胞内p53水平的高低及p53的翻译后修饰对衰老细胞的命运起着重要的决定性作用。而p53的SUMO化作为一种较为新颖的翻译后修饰,目前在内皮细胞衰老的研究中较少见。本课题拟从p53的SUMO化入手,探讨其介导内皮细胞衰老与凋亡逃逸的分子机制。目的:本研究以AOPPs诱导的内皮细胞应激性早衰为模型,探讨p53的SUMO化介导内皮细胞衰老与凋亡逃逸的机制。方法:以人脐静脉内皮细胞为研究对象,用AOPPs诱导的内皮细胞作为应激性衰老的细胞模型,用跨内皮细胞电阻（TER）和FITC荧光漏出实验检测单层内皮细胞通透性;用CCK-8法检测内皮细胞的增殖能力;用Transwell迁移实验检测内皮细胞的迁移能力;使用Matrigel成管实验评价内皮细胞的成管功能;用免疫荧光及免疫印迹检测细胞自噬水平;用β-半乳糖苷酶染色检测衰老细胞比例;用流式细胞术检测凋亡细胞百分比;再分别用RAGE抑制剂、自噬激动剂、自噬抑制剂、转染RAGE siRNA以及p53位点失活型腺病毒,探讨p53的SUMO化在AOPPs诱导的内皮细胞衰老与凋亡逃逸中的作用。用高脂饮食配合药物腹腔注射的方法构建动脉粥样硬化小鼠模型,建模成功后取小鼠主动脉,用油红O染色计算斑块面积,用免疫组化、免疫印迹和免疫沉淀检测血管衰老及自噬相关蛋白的表达及分布。结果:第一部分:AOPP-BSA介导HUVECs屏障功能障碍与血管新生能力减退1.以不同浓度AOPP-BSA刺激HUVECs不同时间,随着AOPP-BSA刺激浓度和刺激时间的增加,HUVECs的跨内皮细胞电阻值逐渐下降,FITC-dextran的漏出量则逐渐增多。2.随着AOPP-BSA刺激浓度的增加和刺激时间的延长,HUVECs的增殖能力逐渐下降,当刺激浓度达200 μg/mL、刺激时间达24 h时出现统计学差异。3.随着AOPP-BSA刺激浓度的增加和刺激时间的延长,HUVECs的迁移细胞数逐渐下降,当刺激浓度达200 μg/mL、刺激时间达12 h时可出现统计学差异。4.当AOPP-BSA刺激浓度达50 μg/mL时,HUVECs的成管能力被明显抑制并出现统计学差异,且在任一时间点观察,HUVECs均未能形成肉眼可见的完整的管状结构。第二部分:AOPP-BSA通过RAGE介导HUVECs衰老与凋亡逃逸1.以 200 μg/mL AOPP-BSA 处理 HUVECs 12h,与对照组相比,AOPP-BSA刺激可诱导衰老细胞比例增多及衰老相关蛋白表达增加。2.以55℃水浴处理HUVECs 10min诱导细胞凋亡作为阳性对照,Annexin V-FITC/PI双染法结果显示AOPP-BSA刺激并未造成内皮细胞明显凋亡,提示AOPP-BSA引起内皮细胞衰老的同时可能介导凋亡逃逸。3.预转染RAGE siRNA敲低RAGE的表达,AOPP-BSA诱导的衰老内皮细胞比例显著下降。第三部分:AOPP-BSA通过抑制自噬介导HUVECs衰老1.以不同浓度AOPP-BSA刺激HUVECs不同时间,AOPP-BSA可使HUVECs中LC3 Ⅱ和Beclin 1的表达减少,p62的表达增加;免疫荧光结果显示,AOPP-BSA使HUVECs的自噬体形成减少,且呈时间和浓度依赖性。2.敲低RAGE的表达或抑制RAGE的功能后,AOPP-BSA介导的自噬抑制被阻断,表现为自噬体形成增多,LC3 Ⅱ的表达较前增加,p62的表达较前下降。3.用Rapa提高HUVECs的自噬水平后,AOPP-BSA处理的HUVECs中p21和p16的表达较前有所降低,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞比例较前显著下降;以3-MA抑制HUVECs的自噬水平后,AOPP-BSA处理的HUVECs中p21和p16的表达增加,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞比例增加。第四部分:AOPP-BSA通过介导p53的SUMO化导致HUVECs衰老1.AOPP-BSA刺激可引起HUVECs中p53的SUMO化水平增高,但p53的表达不受影响。2.Rapa预处理HUVECs后,AOPP-BSA介导的p53 SUMO化水平下降,而3-MA预处理HUVECs后则使AOPP-BSA介导的p53 SUMO化水平增高。3.预转染p53 K386位点失活型病毒后,AOPP-BSA介导的p21和p16的表达量较前下降,衰老细胞比例也较前明显减少。此外,p53在K386位点的乙酰化水平并无改变。第五部分:AOPP-BSA通过抑制血管的自噬水平介导血管衰老1.取各组动脉粥样硬化模型小鼠的主动脉行油红O染色,发现AOPP-BSA组小鼠的斑块面积明显增加,而AOPP-BSA+Rapa组则有所改善。2.与control组和BSA组相比,AOPP-BSA组小鼠血管的LC3表达下降,而p16、p21和p62的蛋白表达均明显增加;与AOPP-BSA组相比,AOPP-BSA+Rapa组小鼠血管的LC3的表达有所增加,p16、p21和p62的表达则有所下降。3.AOPP-BSA可促进血管的p53 SUMO化,且激动自噬可有效减轻AOPP-BSA 介导的 p53 SUMO 化。4.取模型小鼠的主动脉行免疫组化,发现p16、LC3和SUMO1的表达量和分布与免疫印迹结果一致,此外AOPP-BSA和AOPP-BSA+Rapa组的RAGE表达均明显增加。结论1.AOPP-BSA以剂量和时间依赖方式介导内皮细胞通透性增高,并抑制内皮细胞增殖、迁移和成管能力。2.AOPP-BSA通过RAGE促进内皮细胞衰老和凋亡逃逸。3.AOPP-BSA抑制HUVECs的自噬水平,并通过抑制自噬介导HUVECs衰老。4.AOPP-BSA抑制自噬进而增强p53的SUMO化,而p53 K386位点的SUMO化促内皮细胞衰老。5.AOPP-BSA通过抑制血管的自噬水平介导血管衰老,从而促进动脉粥样硬化的发生和发展。