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第一部分转录因子Nrf2与mi RNA的基础关联目的前期mi RNA芯片结果显示,与Nrf2(+/+)小鼠相比,Nrf2(-/-)小鼠的中脑黑质组织中有8个mi RNA表达谱发生显著改变,其中mmu-mi R-128表达下调,mmu-mi R-669c、mmu-mi R-298、mmu-mi R-543、mmu-mi R-770-5p、mmu-mi R-669b*、mmu-mi R-7a、mmu-mi R-544-5p表达上调。通过对ICR-Nrf2(+/+)小鼠和ICR-Nrf2(-/-)小鼠中脑黑质差异表达的mi RNA验证,初步建立转录因子Nrf2与mi RNA的基础关联。方法取6-8 W雄性ICR-Nrf2(+/+)小鼠和ICR-Nrf2(-/-)小鼠(n=3)的中脑黑质组织进行差异表达的mi RNA的q RT-PCR验证。结果选择mmu-mi R-128、mmu-mi R-669c、mmu-mi R-543、mmu-mi R-7a、mmu-mi R-544-5p和mi R-17-5p进行q RT-PCR的验证。与Nrf2(+/+)ICR小鼠组相比,Nrf2(-/-)ICR小鼠中脑黒质组织中mi R-543-3p表达上调(P<0.05),mi R-128-3p表达下调(P<0.01),mi R-669c-5p表达下调(P<0.01),mi R-17-5p表达下调(P<0.01),与芯片结果大体一致。结论芯片结果和q RT-PCR结果均显示,与Nrf2(+/+)小鼠相比,Nrf2(-/-)小鼠中脑黑质组织中有mi RNA表达的变化,可见转录因子Nrf2与mi R-17-5p等mi RNA存在一定的基础关联。第二部分mi R-17-5p在PQ致神经细胞损害中的作用目的前期研究结果表明PQ致神经细胞损害时出现mi R-17-5p表达下调。本实验通过mi R-17-5p功能获得与功能失去在百草枯(PQ)致小鼠神经母细胞瘤细胞(Neuro-2a)细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期改变中的影响,探讨下调的mi R-17-5p在PQ致神经细胞损害中的作用。方法(1)mi R-17-5p mimic和inhibitor分别转染Neuro-2a细胞,6h后通过荧光强度检测转染效率,24h后q RT-PCR检测mi R-17-5p表达水平(n=3);(2)0、50μM、100μM、200μM、250μM、300μM PQ分别处理Neuro-2a细胞48h(n=5),CCK8检测细胞活性;mi R-17-5p mimic和inhibitor分别转染Neuro-2a细胞24h后,50μM、100μM、200μM PQ处理48h(n=5),CCK8检测细胞活性;(3)mi R-17-5p mimic和inhibitor分别转染Neuro-2a细胞24h后,100μM PQ处理48h(n=3),Hoechst-33258染料法和Annexin V-FITC/PI流式细胞仪测定细胞凋亡;(4)mi R-17-5p mimic和inhibitor分别转染Neuro-2a细胞24h后,100μM PQ处理48h(n=3),流式细胞仪测定细胞周期;(5)应用Mirbase,Miranda和Targetscan三个靶基因预测软件预测mi R-17-5p可能靶基因,并结合文献,选定mi R-17-5p的靶基因;不同浓度的PQ处理后,q RT-PCR检测mi R-17-5p的靶基因表达水平。结果(1)各转染组与未转染组Neuro-2a细胞相比,mi R-17-5p表达水平有不同程度的改变;与inhibitor NC组相比,inhibitor组mi R-17-5p表达水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)。与mimic NC组相比,mimic组mi R-17-5p表达水平明显升高,差别有统计学意义(P<0.01);(2)PQ可抑制Neuro-2a细胞的增殖,且存在剂量效应关系;与mimic NC+50μM PQ组相比,mimic+50μM PQ组的细胞增殖升高(P<0.01);与mimic NC+200μM PQ组相比,mimic+200μM PQ组的细胞增殖升高(P<0.01);与inhibitor NC+100μM PQ组相比,inhibitor+100μM PQ组细胞增殖下降(P<0.05);(3)PQ可诱导Neuro-2a细胞凋亡和死亡;mi R-17-5p参与PQ诱导的神经细胞凋亡:Hoechst染色结果显示,与mimic NC+100μM PQ组相比,mi R-17-5p mimic+100μM PQ组的凋亡率下降(P<0.05);流式细胞仪检测显示,与对照组相比,100μM PQ组细胞凋亡率升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与mimic NC+100μM PQ组相比,mi R-17-5p mimic+100μM PQ组的凋亡率下降,差异具有统计学意义(P<0.01);与inhibitor NC+100μM PQ组相比,mi R-17-5p inhibitor+100μM PQ组的凋亡率升高,差异具有统计学意义(P<0.01);(4)mi R-17-5p参与PQ诱导的神经细胞细胞周期改变:与对照组相比,100μM PQ组S期细胞比例明显减少(P<0.01),G0/G1期的细胞比例明显增多(P<0.01);与mimic NC+100μM PQ组相比,mimic+100μM PQ组S期细胞比例明显增多(P<0.05);与inhibitor NC+100μM PQ组相比,inhibitor+100μM PQ组S期、G2/M期细胞比例明显减少(P<0.05);(5)选定Smad7为mi R-17-5p下游靶基因,不同浓度的PQ处理会引起Smad7表达水平升高。结论下调的mi R-17-5p在PQ诱导的神经细胞损害中促进凋亡,抑制增殖。第三部分PQ致神经细胞mi R-17-5p表达改变可能的途径探讨目的应用活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)和Nrf2小分子诱导剂叔丁基对苯二酚(t BHQ)为工具药物预先处理细胞后检测PQ处理引起下调的mi R-17-5p的变化情况,探讨百草枯(PQ)致神经细胞mi R-17-5p的改变途径。此外,探讨PQ对神经细胞DNA甲基化水平的影响,活性氧在PQ引起的DNA甲基化改变中的作用以及DNA甲基化在PQ致神经细胞mi R-17-5p改变中的作用。方法(1)0、100、500μM NAC预处理Neuro-2a细胞2h后,分别用0、100、300μM PQ处理48h,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测mi R-17-5p的表达水平。(2)0、20、40μM t BHQ预处理Neuro-2a细胞4h后,分别用0、100、300μM PQ处理48h,q RT-PCR检测mi R-17-5p的表达水平。(3)0、50、100、300μM PQ处理Neuro-2a细胞48h后,5-甲基胞嘧啶免疫荧光技术检测细胞甲基化胞嘧啶(5m C)含量。(4)0、3μM的DNA甲基化转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷(DAC)预处理Neuro-2a细胞72h后,用0、300μM PQ处理48h,q RT-PCR检测mi R-17-5p的表达水平。(5)0、100、500μM NAC预处理Neuro-2a细胞2h后,分别用0、100、300μM PQ处理48h(每组n=3),处理结束后,用5-甲基胞嘧啶免疫荧光技术检测细胞甲基化胞嘧啶(5m C)含量。结果(1)与对照组相比,100、300μM PQ处理48h,mi R-17-5p表达下调;与100μM PQ组相比,300μM PQ组mi R-17-5p表达下调。结果表明,PQ可诱导Neuro-2a细胞中mi R-17-5p表达下调,且呈浓度效应关系。(2)与对照组相比,100μM、500μM NAC处理后,mi R-17-5p表达上调;NAC和PQ之间存在交互作用,与100μM PQ组相比,100μM NAC预处理后再给予100μM PQ,mi R-17-5p表达上调;与300μM PQ组相比,500μM NAC预处理后再给予300μM PQ,mi R-17-5p表达上调;这些结果表明,NAC可诱导Neuro-2a细胞中mi R-17-5p表达上调。(3)t BHQ和PQ存在交互作用,与300μM PQ组相比,40μM TBHQ预处理后再给予300μM PQ,mi R-17-5p表达上调;(4)与对照组相比,300μM PQ处理的Neuro-2a细胞DNA甲基化免疫荧光强度增强;与对照组相比,3μM的DAC处理的Neuro-2a细胞DNA甲基化免疫荧光强度下降;与300μM PQ组相比,3μM的DAC预处理后再给予300μM PQ,mi R-17-5p表达上调。(5)与对照组相比,100μM NAC处理的Neuro-2a细胞DNA甲基化免疫荧光强度减弱,且NAC和PQ存在交互作用;NAC能够抑制PQ诱导的DNA甲基化水平升高。结论PQ可诱导神经细胞mi R-17-5p表达下调和DNA甲基化水平升高;PQ诱导的活性氧可引起DNA甲基化水平升高;PQ可通过活性氧、DNA甲基化改变引起mi R-17-5p表达下调。