论文部分内容阅读
背景：特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是指原因不明并以普通型间质性肺炎(usual interstitial pneumonia，UIP)为病理特征的一种慢性炎症性肺疾病，病情进行性发展，最终多因呼吸衰竭导致死亡，探讨肺纤维化发生机制，将为其临床治疗提供新思路。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是内皮细胞强烈而特异有丝分裂原，也是一种有效的血管形成和血管通透性因子，是主要血管生成调节因子，它与其受体结合发挥作用。VEGF主要生物学效应是促进血管内皮细胞存活、增殖、分化、迁移和促进新生血管形成。此外，VEGF还可诱导整合素表达，参与炎细胞移动、维持其存活和促进TGF-β1表达等，在肺纤维化形成早期过表达。但目前研究主要集中在抗肿瘤新生血管形成，其致炎作用，特别是在纤维化中作用研究较少。采用VEGF受体阻断剂SU5416阻断VEGF受体信号转导干预肺纤维化，有助于探讨VEGF／VEGFR信号途径在肺纤维化中的作用及其机制。目的：通过检测VEGF及其受体在肺纤维化发生发展过程中表达，了解它们在肺纤维化中的变化特点；利用SU5416在肺纤维化不同时间对VEGF信号干预，了解其抗纤维化作用；经TGF-β1、LDH检测和炎性细胞分类计数等，初探SU5416的抗纤维化机制。方法：小鼠气管内注入博来霉素建立肺纤维化(bleomycin-inducedpulmonary fibrosis，BPF)模型。肺组织，采用HE染色、Ashcroft评分评估纤维化程度；免疫组化法检测VEGF、Flk-1和CD31(新生血管形成)表达；荧光定量RT-PCR分析VEGF、Flk-1 mRNA表达；western-blot法分析p-Smad3。支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，速率法检测LDH活力和白细胞计数、分类计数；用酶联免疫吸附(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)法测定TGF-β1、VEGF含量。结果一、HE染色和Ashcroft评分：镜下见气管内注入博来霉素早期肺组织损伤以胸膜下区明显，肺泡间隔轻度增宽、病灶区域巨噬细胞等炎性细胞浸润明显、胶原纤维沉积少；晚期损伤分布较广，肺组织纤维沉积明显、炎性细胞浸润少。对照组无明显组织炎性浸润和间质纤维沉积。对照组第7、14和28天Ashcroft评分分别为0.325±0.016、0.333±0.017和0.340±0.019；模型组第7天肺组织Ashcroft评分明显升高，第14和28天仍逐渐增加，与对照组比较有显著差异(P<0.01)。肺纤维化SU5416早期处理组Ashcroft评分与对照组相应时间点比较存在差异(P<0.05)，与模型组、溶媒干预组和SU5416晚期处理组比较亦显著差异(P<0.01)。溶媒干预组、晚期SU5416处理组与模型组比较无显著差异(P>0.05)。二、荧光定量RT-PCR与免疫组化：小鼠肺组织VEGF和VEGFR-2 mRNA、蛋白表达，与对照组比较，模型组第7天VEGF、VEGFR-2明显过表达，第14和28天逐渐下降(P<0.01)。SU5416早期干预后，第7和14天VEGF和VEGFR-2 mRNA无过表达，第28天亦有降低(P<0.05)；与对照组比较无明显差异(P>0.05)；与模型组比较有显著差异(P<0.01)。溶媒干预组、晚期SU5416处理组与模型组比较无显著差异(P>0.05)。三、ELISA检测结果：小鼠BALF中VEGF和TGF-β1变化，与对照组比较，模型组第7天VEGF和TGF-β1明显过表达，第14和28天逐渐下降(P<0.01)。SU5416早期干预后，第7和14天VEGF和TGF-β1无过表达，第28天亦有降低(P<0.05)；与对照组比较无明显差异(P>0.05)；与模型组比较有显著差异(P<0.01)。溶媒干预组、晚期SU5416处理组与模型组比较无显著差异(P>0.05)。四、masson染色：与对照组比较，模型组第7天masson兰染胶原IOD值明显升高，第14和28天逐渐增加(P<0.01)。SU5416早期处理后，第7天兰染胶原IOD值无增加；第14和28天稍增加，兰染IOD值与相应时间点对照组比较有明显差异(P<0.05)；与模型组、溶媒和SU5416晚期处理组比较有显著差异(P<0.01)。溶媒干预组、晚期SU5416处理组与模型组比较无显著差异(P>0.05)。五、分光光度法(spectrophotometry)检测肺组织羟脯氨酸含量：与对照组比较，模型组肺组织羟脯氨酸含量变化第7天羟脯氨酸含量明显升高，第14和28天逐渐增加。SU5416早期处理后，第7天羟脯氨酸含量无增加；第14和28天稍增加，羟脯氨酸含量与对照组比较有明显差异(P>0.05)；与模型组比较有显著差异(P<0.01)。溶媒干预组、晚期SU5416处理组与模型组比较无显著差异(P>0.05)。六、新生血管形成：与对照组比较，模型组肺组织新生血管形成第7天新生血管形成明显增多，第14和28天逐渐下降(P<0.01)。SU5416早期干预后，第7和14天新生血管形成无过多现象，第28天稍低(P<0.05)；与对照组比较无明显差异(P>0.05)；与模型组间有显著差异(P<0.01)。溶媒干预组、晚期SU5416处理组与模型组比较无显著差异(P>0.05)。七、western-blot检测p-Smad3表达：SU5416早期处理组p-Smad3表达低于溶媒处理组和晚期SU5416处理组(P<0.01)。溶媒干预组、晚期SU5416处理组间比较无显著差异(P>0.05)。八、速率法检测BALF中LDH活力：第7、14和28天SU5416早期处理组BALF中LDH／P值分别为320.9±15.4和102.4±7.4、106.1±4.7U／mg，(P<0.05)；与模型型组比较显著降低(P<0.01)；与对照组比较稍高(P<0.05)。模型组和溶媒干预组间无明显差异(P>0.05)。九、BALF中白细胞计数和分类计数：造模后第7天，模型组、溶媒组和SU5416晚期处理组BALF中白细胞总数较对照组明显增高，细胞分类计数以巨噬细胞增高明显(P<0.01)；SU5416早期处理组BALF中巨噬细胞、中性粒细胞数较模型组显著降低(P<0.05)。第14天，模型组白细胞总数、巨噬细胞和淋巴细胞较对照组明显高(P<0.01)，与溶媒干预组和SU5416晚期处理组模型组无显著差异(P>0.05)；SU5416早期处理组巨噬细胞、淋巴细胞较对照组高，低于模型、溶媒和SU5416晚期处理组(P<0.05)。第28天，各组间白细胞总数和分类计数均无明显改变(P均>0.05)。结论：一、小鼠肺组织病理特点和Ashcroft评分说明气管内注入博来霉素后建立肺纤维化动物模型成功，并且可用于特发性肺间质纤维化等研究。免疫组化染色示，在博来霉素诱导肺纤维化早期VEGF和Flk-1表达最高、后期很少表达，VEGF、VEGFR可能在肺纤维化形成中起重要作用。二、荧光定量RT-PCR和ELISA提示，肺纤维化仅早期存在VEGF／Flk-1过表达，不同VEGF变异体演变趋势相同；SU5416早期处理可有效阻断早期Flk-1受体和VEGF过表达，Flk-1受体和VEGF有相同变化趋势、SU5416阻断VEGF受体后还可抑制VEGF过表达，说明VEGF和Flk-1间存在相互促进作用。三、Ashcroft评分、masson染色和羟脯氨酸含量等检测发现，在博来霉素诱导肺纤维化过程中，肺纤维化程度、胶原和羟脯氨酸含量呈进行性增高。早期给予SU5416可有效抑制VEGF及其受体过表达，使Ashcroft评分、胶原和羟脯氨酸含量降低。结果提示，VEGF信号在肺纤维化中有重要价值；早期给予SU5416抗肺纤维化，可能是通过抑制早期VEGF／VEGFR信号过表达实现。四、经SU5416分阶段干预，观察新生血管形成、TGF-β1和p-Smad3表达等，模型组新生血管形成、TGF-β1和p-Smad3表达等指标变化趋势与VEGF／Flk-1一致，与纤维化指标相反；早期给予SU5416有效抑制新生血管形成、TGF-β1和p-Smad3表达和VEGF／Flk-1表达。提示VEGF信号途径在肺纤维化中可能经TGF-β1／p-Smad3途径发挥作用；SU5416抗纤维化，可能是阻断早期VEGF、VEGFR过表达，进而抑制TGF-β1／p-Smad3途径实现。五、通过SU5416干预，观察LDH活力和白细胞分类计数等，发现模型组LDH活力和白细胞计数、分类计数变化趋势与VEGF／Flk-1一致，与纤维化指标相反。早期给予SU5416有效降低LDH活力、巨噬细胞计数及VEGF／Flk-1表达，显示VEGF表达与LDH、巨噬细胞计数等密切相关，提示VEGF在肺纤维化早期炎症反应中发挥重要作用；SU5416阻断早期VEGF／VEGFR过表达，也可能抑制了VEGF炎细胞募集及其致纤维化因子释放。由此可见，VEGF／VEGFR信号仅在小鼠肺纤维化形成早期过表达，且相互促进、共同参与肺纤维化过程，仅早期阻断VEGFR能抑制肺纤维化，其机制可能是经TGF-β1／Smad3途径和VEGF的致炎作用引起肺纤维化；SU5416抗纤维化作用很可能是阻断VEGF／VEGFRs信号途径后，TGF-β1／Smad3途径和VEGF的致炎作用受抑制所致。该课题从分子水平进行研究，结果提示VEGF／VEGFR信号途径可能是肺纤维化治疗的潜在靶点，为深入临床IPF等肺纤维化疾病治疗措施研究打下了基础。