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研究背景:光动力疗法（photodynamic therapy,PDT）是一种极具前途的促进创面愈合的新方法,对创面愈合的有效性在临床和动物方面研究均有得到证实。巨噬细胞是创面愈合和炎症反应的关键细胞,但是到目前为止,光动力疗法在促进创面愈合过程中对巨噬细胞的作用机制仍不清楚,光动力疗法对巨噬细胞的研究目前也主要集中在其对巨噬细胞的杀伤作用,对巨噬细胞极化方面的研究还较少。巨噬细胞主要向两种表型分化,即促炎型的M1巨噬细胞和抗炎型M2巨噬细胞。在大量临床及实验研究中发现,光动力疗法治疗后即时的炎症反应明显加重,其早期炎症反应的强度与后期治疗疗效成正比关系。我们课题组前期的研究也发现,光动力可促进创面愈合,在急性炎症期使创面组织中M1即促炎的巨噬细胞增多,提示ALA-PDT治疗早期可能有促进巨噬细胞向M1极化的功能,同时增加局部促炎因子释放,从而加强局部炎症反应。基于此,本课题主要研究光动力疗法早期对巨噬细胞极化的影响,探讨在光动力疗法治疗早期是否影响巨噬细胞极化,使其极化为促炎M1型,并探讨其潜在机制。研究目的:采用小鼠RAW264.7巨噬细胞进行体外实验,探讨ALA-PDT对巨噬细胞极化的影响,以及对其产生的炎症因子和吞噬功能的作用研究。这些发现可能使我们注意到,光动力治疗后创面即时炎症反应加重及有效性可能与促进巨噬细胞的M1型极化有关,这也为ALA-PDT应用于临床提供了理论基础及数据支持。研究方法及分组:1.ALA-PDT对M0巨噬细胞极化的影响首先将RAW264.7小鼠巨噬细胞分为四组进行处理,即（1）对照组（未处理的RAW264.7细胞）（2）ALA组（细胞+1.0m M ALA孵育4h）（3）红光组（细胞+1.5J/cm~2红光照射）（4）PDT治疗组（1.0m M ALA孵育4h+1.5J/cm~2红光照射）。上述处理后使用Western blot、RT-PCR方法检测各组M1/M2巨噬细胞标志物、炎症因子（包括Arg-1、CD86、CD206、TNF-α、i NOS、IL-1β、IL-6）的蛋白和m RNA表达情况,使用活细胞工作站记录并比较各组细胞吞噬能力。2.ALA-PDT对M2巨噬细胞极化的影响首先将RAW264.7细胞分为空白组及处理组,空白组为正常培养的RAW264.7细胞,处理组用IL-4（20 ng/ml）+IL-13（20 ng/ml）共刺激36-48h,通过倒置显微镜拍照并记录细胞形态的变化,Western blot及RT-PCR检测M1/M2巨噬细胞标志物的表达情况,验证是否成功建立M2巨噬细胞极化模型。在建立M2型巨噬细胞模型后,实验分为四组,即（1）对照组（M2型巨噬细胞）（2）仅ALA组（M2巨噬细胞+1.0m M ALA孵育4h）（3）仅红光组（M2巨噬细胞+4J/cm~2红光照射）（4）PDT治疗组（M2巨噬细胞予以1.0m M ALA孵育4h+4J/cm~2红光照射）。使用Western blot、RT-PCR、免疫荧光法检测各组M1/M2巨噬细胞标记物表达变化情况,以CD86、i NOS、TNF-α、IL-6标记M1型巨噬细胞,Arg-1和CD206标记M2型巨噬细胞。3.ALA-PDT对巨噬细胞极化影响的作用机制研究3.1 NLRP3炎症小体通路在其中的作用探讨:将细胞分为四组进行处理（1）对照组（未处理的巨噬细胞）（2）NLRP3炎症小体抑制剂处理组（1u M NLRP3炎症小体抑制剂MCC950共培养1h）（3）PDT治疗组（1.0m M ALA避光孵育4h后予以1.5J/cm~2红光照射）（4）PDT+NLRP3炎症小体抑制剂（1u M NLRP3炎症小体抑制剂MCC950共培养1h后予以1.0m M ALA+1.5J/cm~2红光照射）,使用Western blot方法检测在加入NLRP3抑制剂后,各组NLRP3通路相关蛋白NLRP3、Caspase-1、ASC及CD86、i NOS、IL-1β、TNF-α等蛋白表达情况的变化;3.2 ERK/MAPK通路在其中的作用探讨:将细胞分为四组进行处理:（1）对照组（未处理的巨噬细胞）（2）ERK抑制剂FR180204处理组（10u M ERK抑制剂孵育24h）（3）PDT治疗组（1.0m M ALA避光孵育4h后予以1.5J/cm~2红光照射）（4）PDT+ERK抑制剂组（10u M ERK抑制剂孵育24h后,给予1.0m M ALA+1.5J/cm~2红光照射）。处理后使用WB实验检测各组细胞ERK、p-ERK、CD86、i NOS、NLRP3、Caspase-1、IL-1β等蛋白表达情况;研究结果:1.ALA-PDT促进M0巨噬细胞向M1极化在1m M ALA浓度+1.5J/cm~2红光的光动力条件作用下,通过RT-PCR、WB实验均显示PDT组巨噬细胞M1特征蛋白CD86、i NOS较对照组表达明显增强,M2特征蛋白CD206、Arg-1较对照组表达明显下降,TNF-α、IL-1β及IL-6等炎症因子表达增加,同时,观察到ALA-PDT组巨噬细胞对白念珠菌吞噬率较对照组明显增强。2.ALA-PDT促进M2巨噬细胞向M1型重极化经IL-4+IL-13诱导后的处理组M2相关标记物Arg-1、CD206较未处理组增加,M1相关标记物CD86、i NOS较未处理组降低,表示成功建立M2巨噬细胞模型。q-PCR、WB实验显示在1m M ALA浓度+4J/cm~2红光照射作用下,巨噬细胞M1特征蛋白CD86、i NOS、IL-6、TNF-α较对照组表达明显增强,M2特征蛋白CD206、Arg-1较对照组表达明显下降。3.ALA-PDT促进M1极化影响的作用机制WB结果显示,予以ALA-PDT处理后ERK/MAPK通路蛋白p-ERK蛋白表达增强,NLRP3炎症小体表达增强,即ALA-PDT激活ERK/MAPK和NLRP3通路,加入NLRP3抑制剂MCC950和ERK抑制剂FR180204预处理后,巨噬细胞M1特征蛋白i NOS、CD86的表达被减弱,IL-1β、TNF-α炎症因子表达降低,说明光动力促进巨噬细胞极化及炎症因子的表达与激活ERK/MAPK和NLRP3通路有关。同时,当ERK通路被阻断时,NLRP3炎性体的激活被抑制,Caspase-1蛋白表达显著降低,表明NLRP3是ERK的下游通路。研究结论:1.1m M ALA+1.5J/cm~2红光条件下的ALA-PDT可促进RAW264.7巨噬细胞向M1极化,同时促进炎症因子分泌和吞噬作用。2.1m M ALA+4J/cm~2红光条件下的ALA-PDT可以诱导M2型RAW264.7巨噬细胞细胞向M1重极化。3.ALA-PDT诱导巨噬细胞向M1极化与激活ERK/MAPK--NLRP3信号通路有关。