类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种以关节滑膜增生和软骨破坏为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。在疾病的晚期,常常导致受累关节功能下降,甚至丧失,具有较高的致残率和致畸率。目前对于RA的治疗主要包括手术治疗及药物治疗。手术治疗主要以关节镜手术和人工关节置换术为主。尽管手术治疗可以通过清除病变滑膜和重建关节来改善症状,提高患者生活质量。然而RA是一种全身性的系统性疾病,尤其以对称的多关节发病为主,使得手术治疗仍然具有一定的局限性。药物治疗中常用的药物主要包括抗类风湿药(Disease-modifying Antirheumatic Drugs,DMARDs),糖皮质激素类药物(Glucocorticoids,GCs),非甾体类抗炎药(Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs,NSAIDs)和生物制剂。尽管以上药物在治疗过程中对于降低全身及局部炎症水平、缓解症状、延缓疾病进展等方面取得了良好效果,但仍有一些药物的副作用及药物耐受等问题限制了药物治疗的应用。随着纳米药物载体的发展,一些药物治疗在临床应用中的局限性可以被纳米药物传输系统有效的解决。由纳米技术研发的药物载体具有被动靶向或者同时具有被动及主动靶向的特性,可以将药物特异性地传输并聚集在靶向区域,并且对药物进行控制释放,同时延长药物在血液中的循环时间,减少非靶向区域的药物浓度,从而在提高治疗效果的同时,降低药物剂量及治疗频率,减少全身副作用。因此,应用药物载体使药物更精确地靶向作用于炎症局部,提高炎症关节局部的药物浓度,提高药物有效的循环时间,最大程度地降低药物不良反应的发生,成为RA靶向治疗的关键及热点。在RA的病理过程中,巨噬细胞被激活从而积极地参与到疾病的发展与维持中。活化的巨噬细胞是RA炎症局部多种促炎症细胞因子,例如肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factior,TNF)-α、白细胞介素(Interleukin,IL)-1β和IL-6等的主要来源,使得它与局部的炎症水平、滑膜的病理性增生密切相关。而且,由于活化的巨噬细胞可以上调多种促炎症细胞因子及蛋白酶的分泌,影响软骨与骨代谢,从而在RA关节软骨损伤及骨侵蚀的过程中占有十分重要的地位。在活化的巨噬细胞表面,存在着多种过量表达的受体,如叶酸受体(Folate Receptor,FR)、清道夫受体(Scavenger Receptor,SR)和整合蛋白等。这些受体在正常组织内的巨噬细胞表面很少表达或不表达,而在炎症环境中,巨噬细胞被激活后,使得这些受体在细胞表面特异性地高表达。因此,活化的巨噬细胞可以成为RA靶向治疗中十分理想的靶细胞。本研究目的在于探讨两种主动靶向于活化巨噬细胞的键合药对RA的炎症抑制作用以及对受累关节的软骨保护作用,从而评价活化巨噬细胞靶向的纳米药物在RA治疗中的潜能及优势。我们分别利用活化的巨噬细胞表面特异性高表达的FR和SR,作为主动靶向药物传输体系的靶向受体,应用葡聚糖(Dextran,Dex)和硫酸葡聚糖(Dextran sulfate,DS)作为药物载体,合成两种主动靶向的甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)键合药Dex-g-MTX/FA和DS-g-MTX,同时合成非靶向的键合药Dex-g-MTX作为对照。实验通过核磁共振氢谱(Proton Nuclear Magnetic Resonance,1H NMR)和傅里叶转换红外(Fourier-transform Infrared,FT-IR)确认了键合药的化学结构。通过透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)可以观察到三种键合药在水中可以自组装形成球状的纳米胶束,并且Dex-g-MTX/FA、DS-g-MTX和Dex-g-MTX的流体力学直径通过动态光激光散射(Dynamic Laser Scattering,DLS)测量均在100nm左右,对于纳米药物的靶向特性十分有利。临界胶束浓度(Critical Micelle Concentration,CMC)测定了三种MTX键合药形成纳米胶束所需要的最低浓度,并从结果发现远低于治疗浓度。通过溶血实验观察到三种MTX键合药对血液具有良好的生物相容性。在体外释放实验中,MTX在37°C,p H=7.4的环境中可以被缓慢的释放。随后,我们在体外应用激光共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM)和流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)来观察活化的巨噬细胞对三种MTX键合药的内吞行为。结果显示,Dex-g-MTX/FA和DS-g-MTX对活化的巨噬细胞展示出了良好的靶向性,通过FA-FR和DS-SR之间的特异性识别,显著增加了活化的巨噬细胞对两种键合药的内吞,而对于Dex-g-MTX而言,无论巨噬细胞是否被活化,细胞对其内吞行为无明显改变。通过MTT检测,可以观察到Dex-g-MTX/FA和DS-g-MTX对活化的巨噬细胞毒性要大于Dex-g-MTX的毒性,进一步证实了Dex-g-MTX/FA和DS-g-MTX可以通过FR和SR加强活化的巨噬细胞的内吞行为,进而增大了细胞毒性。最后,通过小鼠CIA模型来分别验证Dex-g-MTX/FA和DS-g-MTX的体内治疗效果。结果表明,Dex-g-MTX/FA和DS-g-MTX分别与非靶向的键合药Dex-g-MTX相比,可以更好地缓解关节症状,抑制关节炎症,减少滑膜增生。同时,通过显著抑制局部促炎症细胞因子的表达,两种主动靶向巨噬细胞的键合药可以更好的减少关节破坏,保护关节软骨不被侵蚀,并且降低血清中促炎症细胞因子的浓度,控制全身炎症水平。在本课题中,我们通过化学手段合成了两种主动靶向于活化巨噬细胞的MTX键合药Dex-g-MTX/FA和DS-g-MTX。两者虽然均具备合适的大小,良好的生物相容性以及对MTX控制释放的特性,但是通过实验证明DS-g-MTX对于CIA的靶向性及治疗效果均优于Dex-g-MTX/FA,并对关节软骨起到更好的保护作用,为RA靶向治疗提供依据。最为重要的是,通过纳米载体主动靶向于活化的巨噬细胞,可以大大提高药物的炎症抑制效果,显著降低局部及全身的促炎症细胞因子水平,甚至为其他慢性炎症的治疗提供了一种理想的治疗策略。