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目的本研究针对我国消除疟疾阶段流行程度较低,存在一定比例的低原虫密度的疟疾病例,以至镜检难以发现潜在传染源这一主要问题,围绕低密度疟原虫血症的定量界定、实验室检测技术的比较以及现场样本的检测,通过对以PCR为基础的三种分子生物学检测方法进行实验室和现场检测比较研究,以探讨适合低密度疟原虫血症患者的较为灵敏检测方法,在此基础上了解疟疾症状人群中低密度疟原虫血症患者的程度和比例,为我国消除疟疾传染源发现与管理以及诊断参比实验室网络建设充实技术方法与理论依据,具有一定的理论价值和现实意义。方法研究分两大部分,分别为：低密度疟原虫血症实验室检测方法比较和低密度疟原虫血症现场检测与验证。第一部分采用恶性疟原虫(FCCI/HN)体外培养及同步化、显微镜及三种常用分子生物学技术,对实验室培养的同步化的恶性疟原虫血和现场采集的间日疟原虫血进行了稀释和梯度检测,以镜检技术无法检出的稀释梯度上的原虫密度为临界值界定低密度疟原虫血症。对上述低密度恶性疟原虫和间日疟原虫血样进一步梯度稀释,采用多重PCR、巢式PCR、实时PCR三种分子生物学方法对不同稀释梯度的血样逐一检测,比较不同方法的检测限及检出率。第二部分在实验室研究的基础上运用三种PCR方法同时对现场采集的147份镜检阴性但具有发热症状的疟疾疑似病例样本进行检测,以进一步现场验证三种方法的检测敏感性,并评价研究现场低密度疟原虫血症的比例。(1)通过实验室培养及同步化处理获取一定浓度的环状体期占99%以上的恶性疟原虫血1份,通过现场采集的方式获取间日疟原虫外周血样本1份,并分别涂制血膜,其中厚血膜用血量约4～4.5μl,薄血膜用血量1～1.5μl,利用吉氏染色法进行染色,由2名有经验的疟原虫镜检专家(经WHO认证Ⅲ级以上专家)进行显微镜检测并计数原虫密度,其中对来自实验室培养的恶性疟原虫血按红细胞数为4.5×106个/μl血采用薄血膜计数法进行计数；对来自现场的间日疟原虫血样本则采用白细胞计数法计数原虫密度,其中白细胞的计数以实际计数为准(本样本为3.2×103个白细胞/μl血)。(2)利用健康O型血对上述浓度已知的间日疟原虫血样和恶性疟原虫血样按照1：40、1：80、1：160、......1：40960等11个浓度梯度进行倍比稀释,每一浓度分三组每组3张血片进行涂片镜检,由2名有经验的疟原虫镜检专家进行检测,确定每一浓度所有血的显微镜检测结果,整张厚血膜未发现疟原虫者记为阴性。当某一浓度3张血片都为阴性时,该浓度的上一浓度即为低密度疟原虫血症的临界浓度(即显微镜检测限)本研究将浓度低于该值的疟原虫血样定为低密度疟原虫血样；(3)对显微镜检测确定的低密度疟原虫血样按照(1：2、1：22、1：23、1：24、1：25......)进行倍比稀释并利QIAamp DNA mini kit提取DNA,同时利用三种常用的分子生物学方法(多重PCR、巢式PCR、实时PCR)对每一浓度梯度样本进行检测,并对三者的检测限和不同浓度的检出率进行统计学分析,检测限低、各浓度检出率高的检测方法即为本研究的适合低密度疟原虫血症检测的方法；(4)利用QIAamp DNA mini kit提取现场采集的147份具有发热症状但通过显微镜检测结果为阴性的疟疾疑似病例的滤纸血样本DNA,并同时利用上述三种分子生物学方法进行检测,统计各种分子生物学方法的检出率,利用χ2检验对三种方法的检测率进行比较分析,从而对三种方法进行现场检测和验证。结果(1)对于恶性疟原虫：显微镜检测的临界值为21.92个虫/μl血,多重PCR、巢式PCR和实时PCR的检测限分别为0.1713个虫/μl血、0.0856个虫/μl血、0.1713个虫/μl血。当原虫密度为0.1713个虫/μl血时,三种方法检出率分别为66.7%(6/9)、100%(9/9)、100%(9/9),差异具有统计学意义(P<0.05)；当原虫密度为0.0856个虫/μl血时,三种方法检出率分别为0%(0/9)、66.7%(6/9)、55.6%(5/9),差异具有统计学意义(P<0.05)；当原虫密度为0.0428个虫/μl血时,三种方法检出率分别为0%(0/9)、33.3%(3/9)、44.4%(4/9),差异具有统计学意义(P<0.05)；当原虫密度为0.0214个虫/μl血时,三种方法检出率分别为0%(0/9)、11.1%(1/9)、11.1%(1/9),差异不具有统计学意义(P>0.05)；当原虫密度为0.0107个虫/μl血时,三种方法均未能检出,检出率均为0%(0/9)。(2)对于间日疟原虫：显微镜检测的临界值为11.06个虫/μl血,多重PCR、巢式PCR和实时PCR的检测限分别为0.3455个虫/μl血、0.0864个虫/μl血和0.3455个虫/μl血。当原虫密度为0.1728个虫/μl血时,三种方法检出率分别为0%(0/9)、100%(9/9)、11.1%(1/9),差异具有统计学意义(P<0.05)；当原虫密度为0.0864个虫/μ1血时,三种方法检出率分别为11.1%(1/9)、77.8%(7/9)、100%(9/9),差异具有统计学意义(P<0.05)；当原虫密度为0.0432个虫/μl血时,三种方法检出率分别为0%(0/9)、66.7%(6/9)、0%(0/9),差异具有统计学意义(P<0.05)；当原虫密度为0.0216个虫/μl血时,三种方法检出率分别为0%(0/9)、11.1%(1/9)、0%(0/9),差异不具有统计学意义(P>0.05)。(3)对现场采集的147份镜检阴性的疟疾疑似病例血样中,三种方法分别检出阳性：3例、13例、8例。检出率分别为2.0%(3/147)、8.8%(13/147)、5.4%(8/147),差异具有统计学意义(P<0.05)。巢式PCR检测结果显示低密度疟原虫血症患者在显微镜镜检阴性的疟疾疑似病例中所占比例为8.8%(13/147),由此推断我国云南省腾冲县低密度疟原虫血症患者的比例约为：8.8%,95%CI为(4.2%,13.4%)。结论结果表明：镜检技术对恶性疟原虫的检测限为21.96个虫/μl血,间日疟原虫为11.05个虫/μl血,以此临界值界定低密度疟原虫血症。三种PCR检测技术均能一定程度地检测低密度疟原虫血症血样,其中巢式PCR方法检测限最低(对恶性疟原虫血达0.0856个虫/μl血,对间日疟原虫达0.0864个虫/μl血),不同浓度下,检出率较多重PCR和实时PCR高。其灵敏度明显高于其它两种方法。现场采集的147份镜检阴性但具发热症状(设定为低密度疟原虫血症患者)血样检测结果也显示巢式PCR的检出率最高,检出13例,表明研究现场低密度疟原虫血症患者高达8.8%(4.2%,13.4%)。