肝脏缺血-再灌注损伤(hepatic ischemia with reperfusion injury,HIRI)常见于肝脏移植、失血性休克、创伤等情况,HIRI发生机制复杂。肝脏中度缺血及再灌注早期损伤多较轻微,肝细胞轻度肿胀,少数水样变性,肝功能指标无显著性改变。而中度以上缺血,随再灌注时间延长,血管收缩,血小板聚集引起微循环再灌注不足,能量供给障碍造成肝细胞、内皮细胞以及Kupffer细胞肿胀,进一步对肝脏的微循环造成了严重损害,继而引起Kupffer细胞和中性粒细胞活化,产生炎性细胞因子和氧自由基。这些物质作用于细胞并产生相应生物学效应是较复杂的病理生理过程。细胞内信号转导通路在该过程中起桥梁作用,近期研究显示Janus激酶信号转导与转录激活子(Januskinase signal transduc-ers and activators of transcription,JAK-STAT)信号转导通路参与了HIRI,并与细胞凋亡有关。本实验研究肝脏缺血45min再灌注不同时限JAK-STAT信号通路中STAT1及caspase3在肝细胞的表达情况,并观察丹参对其影响。目的建立大鼠肝脏缺血-再灌注损伤模型,观察JAK-STAT信号通路蛋白STAT1和Caspase3在大鼠肝脏缺血45min再灌注不同时限的表达情况及丹参对两者表达的影响。探讨JAK-STAT信号通路在HIRI中的作用,进一步了解HIRI的信号转导机制,旨在为治疗HIRI提供新的思路。方法1、成年健康SD雄性大鼠80只,随机分为四组:正常组(n=5)、缺血-再灌注组(n=25)、假手术组(n=25)、丹参组(n=25),后3组又根据再灌注后不同时间(0h、3h、12h、24h、72h)随机分为5个亚组,每组5只。2、正常组:术前30min经尾静脉注入生理盐水40ml/kg,以3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔内注射麻醉,取上腹正中切口长约3 cm,进腹后直接取材。缺血-再灌注组:术前输液同前,进入腹腔游离肝蒂后,用无损伤动脉钳夹闭,全血流阻断45min后撤除动脉钳,分别于复流0h、3h、12h、24h、72h取材。假手术组:术前输液同前,进入腹腔后仅游离肝蒂但不阻断,与缺血-再灌注组相同时限点取材。丹参组:丹参注射液6g/Kg加生理盐水至40ml/Kg,术前30min经尾静脉推入,余麻醉、手术方法及取材同上。3、大鼠肝脏标本取材后经10%的福尔马林固定,梯度酒精脱水,石蜡包埋,常规制备4μm厚连续切片。电镜标本取材后即放入预先配置的3%戊二醛中固定20min后进行修块取材。4、肝脏标本切片按HE常规染色步骤进行染色。STAT1与Caspase-3免疫组化检测试剂盒购于武汉博士德生物制品公司,免疫组织化学采取SABC法,实验步骤按试剂盒内说明书进行,一抗浓度为1:100。5、STAT1免疫组化结果以细胞核或细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性表达,Caspase-3阳性判断标准为胞质内出现棕黄色颗粒。各组切片均采用HPIAS—1000高清晰彩色病理图像分析系统对免疫组化染色阳性反应产物进行定量分析。每张切片取10个200倍视野记录阳性单位(positive unit,PU),取其平均值,以PU值大小代表阳性产物表达的多少。6、数据以平均值±标准差((?)±s)表示,采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,采取析因设计方差分析分析主效应与交互效应后,SNK法检验各组间差别。两个变量间相关性分析采用双变量相关分析(Bivariate)。P＜0.05代表有统计学意义。结果1、STAT1在正常与假手术组各时限点肝脏细胞内未见明显表达,两组比较无显著性差异(P＞0.05)。缺血-再灌注组再灌注0h STAT1在靠近中央静脉区周围肝细胞浆内出现STAT1棕色淡染颗粒,随再灌注时间延长,STAT1表达细胞逐渐增多,汇管区亦出现表达,12～24h表达最显著,72h尚有表达。丹参组STAT1较同期缺血-再灌注组低(P＜0.05)。(见表1)2、Caspase3在正常组及假手术组未见明显表达,两组比较无显著性差异(P＞0.05)。再灌注0h在肝窦内皮细胞及中央静脉周围肝细胞中可见表达,随再灌注时间的延长,肝细胞表达逐渐增多,在再灌注24 h达到峰值,72 h回落至基线水平。丹参组Caspase3阳性表达均显著低于同期缺血-再灌注组(P＜0.05)。(见表2)3、缺血-再灌注组,STAT1与caspase3呈显著正相关关系(P＜0.01);丹参组,STAT1与csapase3呈显著正相关关系(P＜0.01)。4、HE染色光镜下观察:正常组及假手术组的肝脏结构基本完整,肝细胞连续成索,胞核大而圆。缺血45min再灌注即时可见肝细胞轻度水肿,排列紊乱拥挤,肝窦间隙变窄;3 h时可见肝细胞肿胀,胞质疏松呈网状,半透明:12h时肝细胞呈弥漫性肿大,气球样变,肝小叶内可见点状坏死与嗜酸性小体;24 h时损伤最重,可见肝小叶变形,部分出现片状坏死,汇管区可见炎性细胞浸润;72 h时可见肝窦间隙狭窄减轻,肝小叶重构。相同时限点丹参组损伤程度与范围等均较缺血-再灌注组轻。5、电镜下病理观察:电镜下正常对照组及假手术组超微结构形态基本正常:缺血45min再灌注即时电镜下即可见到线粒体及内质网轻度肿胀,余细胞器未见明显异常改变;3 h时可见线粒体嵴变短,肿胀加重,核染色质浓缩边集;12h时可见细胞核皱缩,细胞器呈区域状分布,糖原消失,胞核皱缩;24 h时可见肝细胞核皱缩,少数细胞可见固缩死亡,亦可见恢复及新生的肝细胞;72 h时肝细胞恢复正常。相同时限点丹参组较缺血-再灌注组损伤轻。结论本研究发现:在正常及假手术组大鼠肝组织中STAT1、caspase3表达极弱。缺血45min再灌注0h在靠近中央静脉区肝细胞浆内出现STAT1棕色淡染颗粒,随再灌注时间延长,STAT1表达细胞逐渐增多并在汇管区出现表达,12～24h达峰值,72h尚有表达。缺血45min再灌注0h caspase3亦有表达,随再灌注时间延长表达逐渐增多,主要集中于中央静脉及汇管区周围,再灌注24h达到峰值,在72h后回落至假手术组水平。实验验证了缺血-再灌注损伤可诱发肝细胞表达STAT1蛋白,行相关性分析显示STAT1与caspase3呈正相关,两者表达的动态变化基本一致。STAT1被激活的具体机制尚不清楚,可能的机制有:HIRI过程中释放大量炎性细胞因子(如IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ)激活JAK-STAT信号转导系统,尤其是IFN-γ能强烈地诱导STAT1表达增高。同时氧化应激也能激活JAK/STAT信号通路,HIRI中产生的氧自由基激活JAK-STAT信号通路,另有研究表明再灌注后肠源性内毒素(LPS)能通过间接途径激活JAK-STAT信号转导通路,从而导致STAT1的活化。再灌注12～24h属亚急性期,仍有大量炎性因子及氧自由基生成,而此期STAT1表达未见明显增加,这可能与细胞信号抑制蛋白(SOCS)表达有关,细胞因子可刺激SOCS的产生,而SOCS又反过来抑制细胞因子激活的JAK-STAT信号通路,对STAT1表达起负反馈调节,从而使STAT1在此期表达处于平衡状态。STAT1最先在中央静脉区的肝细胞中表达,随再灌注时间延长STAT1表达逐渐增多并在汇管区出现表达,分析其原因可能是由于中央静脉区细胞供血较差,氧浓度较低,对缺氧损伤最敏感,阻断肝血流后缺血性损伤最先累及中央静脉区,缺氧因素作为一个重要的信息分子并通过各种炎性因子的释放刺激STAT1的活化表达。随再灌注时间延长,肝窦内皮细胞肿胀,血流不能顺利流入中央静脉,出现再灌注后无复流现象,大量炎性因子及肠源性内毒素堆积于汇管区,从而促使该区STAT1的高表达。从对STAT1与caspase3空间分布的观察我们发现两者表达的区域基本一致,主要都分布于中央静脉及汇管区周围,结合两者的空间分布与动态变化的一致性我们推测:肝脏缺血-再灌注过程中产生的细胞因子、氧自由基以及转移的肠源性内毒素有可能通过信号通路蛋白STAT1的活化表达促进了caspase3的表达,诱导了细胞凋亡的发生。诸多研究表明丹参对重要脏器缺血-再灌注损伤有保护作用,认为主要作用原理为丹参可解除血小板凝聚、改善微循环灌注不足、抗氧自由基。本研究发现丹参处理后肝脏内STAT1表达相对低于缺血-再灌注组水平,同时caspase3表达亦相对较低,病理损伤程度相对较轻。这可能是因为丹参处理后改善微循环使炎性细胞因子产生减少,同时其抗氧自由基作用抑制了氧化应激反应,由此在一定程度上抑制了STAT1的高表达。本研究提示丹参对中介物质的JAK-STAT信号通路也有影响,但其对JAK-STAT信号通路的影响是通过减少触发因素的间接作用,还是直接作用于JAK-STAT信号通路尚有待进一步研究。