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第一部分NaF对SH-SY5Y细胞线粒体功能和融合分裂相关蛋白表达的影响目的:长期摄入过量氟具有神经毒性,但其作用机制尚未阐明。本研究采用不同浓度氟化钠(sodium fluoride,NaF)对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞进行染毒处理,观察NaF对线粒体功能和线粒体融合分裂相关蛋白表达的影响,从而为进一步阐明氟神经毒性机制提供相关的理论依据。方法:体外培养的SH-SY5Y细胞暴露于不同浓度NaF(20 mg/L、40 mg/L、60mg/L),利用线粒体超氧化物指示剂MitoSOX~TMM Red和线粒体膜电位探针JC-10标记细胞,采用流式细胞术分别检测SH-SY5Y细胞线粒体ROS(MitoROS)生成和线粒体膜电位(△Ψm)的水平;同时,采用Western blot技术检测细胞线粒体融合相关蛋白线粒体融合蛋白1(mitofusion 1,Mfn1)和线粒体融合蛋白2(mitofusion2,Mfn2),以及分裂相关蛋白动力素相关蛋白1(dynamin related protein 1,Drp1)和分裂蛋白1(fission 1,Fis1)的表达水平。结果:随着NaF染毒浓度的增加,MitoROS生成随之增多,△Ψm随之下降。与对照组相比,60 mg/L NaF染毒组细胞MitoROS生成增加最为明显(P<0.05),20mg/L、40 mg/L、60 mg/L NaF染毒组细胞△Ψm均明显下降(P<0.05)。融合相关蛋白Mfn1和Mfn2的表达水平随着NaF染毒浓度的增加而增加,且40 mg/L和60mg/L NaF染毒组增加有显著统计学意义(P<0.05);与对照组相比,60 mg/L NaF染毒组的分裂相关蛋白Drp1和Fis1的表达水平明显降低(P<0.05)。结论:NaF可导致线粒体损伤,同时促进线粒体融合,抑制其分裂,引起线粒体融合分裂发生异常。第二部分线粒体融合分裂在NaF致SH-SY5Y细胞线粒体功能损伤中的作用目的:探讨线粒体分裂抑制剂Mdivi-1联合NaF对SH-SY5Y细胞线粒体融合分裂相关蛋白表达和线粒体功能的影响。方法:将体外培养的SH-SY5Y细胞分为对照组、NaF染毒组(60 mg/L NaF)、Mdivi-1处理组(10μM Mdivi-1)和Mdivi-1+NaF染毒组(Mdivi-1预处理30 min后再用NaF进行染毒)。用Western blot方法检测细胞线粒体融合相关蛋白Mfn1和Mfn2,以及分裂相关蛋白Drp1和Fis1的表达水平;同时采用MitoSOX~TMM Red和JC-10标记细胞后,利用流式细胞术分别检测MitoROS和△Ψm。结果:与单纯NaF染毒组相比,Mdivi-1+NaF染毒组线粒体融合相关蛋白Mfn1和Mfn2的表达水平进一步显著增加(P<0.05),分裂相关蛋白Drp1和Fis1表达进一步下降,其中Fis1降低具有统计学意义(P<0.05)。同时,Mdivi-1处理后,MitoROS生成进一步增多(P<0.05),而△Ψm水平进一步降低(P<0.05)。结论:抑制线粒体分裂可明显增强线粒体融合,说明NaF可通过影响线粒体融合分裂过程,进而导致SH-SY5Y细胞线粒体损伤。