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过敏性疾病是由于机体受到抗原刺激引起组织损伤或功能紊乱的免疫反应,过敏反应具有发作迅速、反应强烈、消退较快等特点,常在再次接触过敏原时反复发作。目前如何控制过敏性疾病进程,改善体质,减少复发是最令人关注的问题。MicroRNAs (miRNAs)是一类内源性非编码的单链小分子RNA,对过敏性疾病中Th1/Th2平衡和细胞因子的影响已有报道,且在过敏性皮炎、鼻炎和哮喘的发病进程中发挥重要作用。但在过敏性疾病进程中的变化及在复发前的缓解期的表达尚不明确。玉屏风散(YPF S)来源于《丹溪心法》,由防风、黄芪、白术三味药组成,本实验室前期研究表明玉屏风散可显著抑制小鼠过敏性炎症,且在小鼠变应性接触性皮炎(Allergic Contact Dermatitis,ACD)复发模型中,缓解期给予YPFS,可抑制发作效应。同时对玉屏风散含药血清的分析发现升麻素在血清中含量较高,且前期研究发现升麻素在激发期和诱导相给药均可显著性抑制小鼠过敏性炎症,但在致敏初期给药及复发缓解期给药对ACD的作用及机制尚不清楚。本课题主要从以下三个方面展开研究：1.基于MicroRNAs (miRNAs)调控上皮细胞连接蛋白探讨过敏性皮炎复发的发病机制利用已建立的小鼠ACD复发模型,采用基因芯片技术考察缓解期1niRNAs的变化,对表达差异显著的miRNAs进行PCR验证；对几种miRNAs在ACD复发各阶段(致敏初期、首次激发前、首次激发后、缓解期、二次激发期)的变化趋势进行考察；对]miRNAs靶基因进行预测,选取结构蛋白相关的靶基因在细胞水平进行验证,考察miRNAs对上皮连接蛋白的调控作用。2.升麻素致敏初期对小鼠ACD的影响及对ACI)复发的效应应用FITC建立小鼠致敏初期给药观察全程效应ACD模型,仅在致敏初期给予升麻素,观察对小鼠耳肿胀度、免疫器官及耳组织病理组织学的影响,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-9、IL-13表达的水平；利用已建立的小鼠ACD复发模型考察升麻素是否能减轻ACD复发时的炎性症状,在缓解期给予升麻素连续10天,于末次给药结束后48h再次激发小鼠,量取小鼠耳厚,计算耳肿胀,观察耳组织病理结构改变,检测耳组织内IL-4、IL-5、IL-9、IL-13表达水平。3.升麻素对上皮细胞连接蛋白及miR-155-5p,miR-146a-5p表达的影响建立致敏初期三天模型,考察升麻素对上皮细胞完整性及连接蛋白CLDND1、CLDN-1、 Occludin的影响；在ACD复发模型中,于缓解期和发作期考察升麻素对上皮连接完整性及CLDND1、CLDN-1、Occludin的影响；升麻素体外对上皮细胞连接蛋白及]miR-155-5p,miR-146a-5p表达的影响。研究结果：1.miRNAs在过敏性疾病缓解期有明显变化,其中mir-155-5p对上皮细胞连接蛋白有调控作用。miRNAs基因芯片结果显示,与空白组相比,缓解期上调的miRNAs有55个,下调的有73个,其中在缓解期发生变化的部分niRNAs在二次激发后持续发生变化。对基因芯片结果中缓解期上调显著的miR-155-5p,miR-146a-5p,miR-3473b,miR-3473d,在缓解期下调显著的miR-677-3p,miR-770-5p,miR-5119进行验证,结果显示miR-146a-5p和miR-3473b在缓解期显著性上调；miR-155-5p在缓解期上调明显。miR-770-5p,miR-5119在缓解期下调明显。考察miR-155-5p,miR-146a-5p,miR-3473b,miR-770-5p,miR-5119在ACD复发模型各时期(致敏初期、激发期、缓解期、二次激发后效应期)的变化,结果显示niR-146a-5p、miR-155-5p和miR-3473b在致敏初期持续至缓解期显著性上调,miR-770-5p在第一次激发期至缓解期下调明显。提示在第一次接触过敏原时miRNAs即发生变化,缓解期时niRNAs并未恢复。对差异表达的miRNAs进行靶基因预测,发现miR-155-5p的靶基因为Claudin家族的CLDN16、CLDND1。在TKF-α和Poly(I:C)等刺激条件下,HaCaT细胞中miR-155-5p表达显著性升高,其预测靶基因CLDN16、CLDND1表达减少,同时结构蛋白Occludin、CLDN-1表达减少,加入miR-155-5p抑制剂后,CLDN16、CLDND1及Occludin表达增加。提示miR-155-5p可能通过靶标CLDN16、CLDND1调控其它连接蛋白的表达。2.升麻素在小鼠ACD致敏初期及ACD复发缓解期给药可抑制其过敏效应。仅在致敏初期给予升麻素即对ACD小鼠耳肿胀及耳重有显著抑制作用；模型组小鼠耳组织明显增厚伴有水肿,炎症细胞浸润明显,耳组织真皮层组织明显水肿。升麻素12.5mg·kg-1、50 mg·kg-1组有减轻耳病理组织学改变的影响；对2型细胞因子IL-5、IL-9、IL-13亦有降低作用。这提示升麻素在致敏初期给药就可以导致其最终对炎症的抑制；小鼠ACD复发模型缓解期连续给药10天,升麻素能明显减轻效应期小鼠耳肿胀程度、耳组织炎症浸润及炎症因子,表明升麻素通过调整病理状态下的机体发生变化而发挥长期效应,而非仅短期内控制炎性症状。3.升麻素可通过抑制miR-155-5p进而调控上皮连接蛋白发挥抗过敏性炎症复发的作用。对致敏初期可能机制进行探讨,发现升麻素可使上皮结构蛋白表达增加,维持上皮细胞连接完整性,增加连接蛋白CLDND1、CLDN-1、Occludin的表达；同样在ACD复发模型缓解期的研究发现,升麻素使连接蛋白CLDN-1、CLDND1及Occludin表达较模型组明显增加,提示升麻素能抑制ACD复发时过敏性炎症与上皮紧密连接蛋白有密切关系。体外研究发现升麻素可抑制miR-155-5p,并使CLDN16、CLDND1、CLDN-1和Occludin蛋白表达增加。提示升麻素是通过抑制miR-155-5p使CLDN-16、CLDND1、CLDN-1、Occludin表达增多进一步使炎症因子表达减少,发挥抑制过敏性皮炎的作用。结论：1. miRNAs在过敏性疾病缓解期有明显变化,在ACD复发进程中持续存在,其中miR-155-5p可抑制上皮细胞连接蛋白CLDND1、CLDN16及Occludin的表达。2.升麻素在小鼠ACD致敏初期及ACD复发缓解期给药可抑制其过敏效应。其抗过敏性炎症复发作用机制是通过抑制miR-155-5p使CLDND1、CLDN16及Occludin表达增加,Th2型细胞因子表达减少来实现的。3.干预过敏性疾病缓解期的miRNAs可能是减少过敏性疾病复发的有效途径。