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鱼类性别决定具有较高的可塑性,尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）性别决定既受遗传因素调控,又受温度影响,在性别分化期,高温（36℃）能诱导XX遗传雌鱼性逆转为生理雄鱼,因此,尼罗罗非鱼的性别决定机制为遗传+温度性别决定（Genetic sex determination+temperature effect,GSD+TE）。但温度是如何影响尼罗罗非鱼性别决定的,其分子机制仍然不清楚。有研究表明在昆虫、爬行类和哺乳类等动物中,某些关键性别决定基因受可变剪接的调控。本文研究了高温对尼罗罗非鱼性腺pre-m RNA可变剪接的影响及可能机制,结果如下:1.高温处理性腺的Pac Bio Iso-Seq（Isoform-sequencing）分析。将9 dpf的尼罗罗非鱼遗传雌鱼（XX）36℃高温处理30 d（39 dpf）,取高温处理雌鱼组（FT）和对照雌鱼组（FC）的性腺组织进行Pac Bio Iso-Seq。FC和FT组分别识别出4,478和5,504个可变剪接基因,占编码基因的47.78%和50.10%;分别识别出10,649和14,302个可变剪接事件,其中内含子保留（Retented intron,RI）事件占比最大。分析两组中特有和共有的7种可变剪接事件数目,RI事件的共有数目最多,可变首外显子（Alternative first exon,AF）事件的特有数目最多。分析重要性别决定和分化相关基因的可变剪接情况,发现高温处理能增加Kdm6bb等11个性别分化相关基因的可变剪接类型。2.Pac Bio Iso-Seq和RNA-Seq联合分析筛选FT和FC组间差异表达转录本（Differential expression transcripts,DETs）。联合分析共筛选出122个DETs,65个上调,57个下调,共对应了115个基因。108个基因与DETs一一对应,剩余7个基因均对应2个DETs。本实验室21 dpf罗非鱼性腺组织RNA-Seq共筛选到了298个差异表达基因（DEGs）。DETs对应基因与DEGs共有8个基因重叠。3.高温胁迫下Kdm6bb可变剪接事件分析。高温对RI5事件的发生频率影响最大（FC:68.42%,FT:5.00%）,RI5是高温影响Kdm6bb可变剪接的主事件。SQ-PCR显示,FT组的脑、肾、肌肉、鳃、脾脏、肠和性腺组织中第5内含子的剪接比例均显著高于FC组（P<0.05）。在FC、FT和正常雄鱼性腺中,第5内含子的剪接比例分别为34.30±1.06%、92.11±3.28%和59.30±1.71%。4.筛选可能调控Kdm6bb第5内含子剪接的关键顺式作用元件。构建了p CI-neoKdm6bb质粒,转染至罗非鱼胚胎干细胞（TES1）和斑马鱼胚胎细胞（ZF4）,半定量PCR（SQ-PCR）显示2种细胞都无Kdm6bb的表达产物,转染后多对引物都只能检测到RI5和Δ5（第5内含子正常剪接）条带,且TES1细胞的转染效率显著高于ZF4,因此,选择TES1细胞用于体外研究Kdm6bb第5内含子的剪接模式。将第5内含子以18个碱基为单元进行缺失,构建17种缺失质粒,转染至TES1细胞。SQ-PCR显示,与p CI-neoKdm6bb（WT,wild type）相比,D181-198和D253-269显著增加了第5内含子的剪接比例（P<0.05）;缺失体D37-54显著降低了剪接比例（P<0.01）,初步表明181-198和253-269区段可能是调控第5内含子剪接的内含子剪接抑制子元件（ISS）,37-54区段可能是内含子剪接增强子元件（ISE）。5.筛选可能调控Kdm6bb第5内含子剪接的剪接因子。利用cat RAPID预测Kdm6bb第5内含子和侧翼外显子序列上可能结合的能调控内含子剪接的剪接因子,发现其上有8个MBNL1（Muscleblind like splicing regulator 1）的结合位点,Ⅰ-Ⅴ在内含子5中,Ⅵ-Ⅷ在外显子6中。以p CI-neo-Kdm6bb为模板,PCR扩增得到MBNL1结合位点突变的片段,构建4种突变质粒,转染至TES1细胞。SQ-PCR显示,与WT相比,MⅠ-Ⅷ中第5内含子的剪接比例显著增加（P<0.01）;MⅠ-Ⅴ中剪接比例也显著增加（P<0.01）,且比MⅠ-Ⅷ高;但MⅥ-Ⅷ中剪接比例显著降低（P<0.01）,这表明MBNL1s可以与相关位点结合调控第5内含子剪接。因此,MBNL1可能是调控Kdm6bb第5内含子剪接的剪接因子。综上所述,本研究发现高温处理能显著改变罗非鱼性腺pre-m RNA的剪接模式,增加可变剪接事件数目,筛选出参与性别决定的可变剪接基因Kdm6bb,RI5是高温影响其可变剪接的主事件,且高温能上调多种组织中Kdm6bb第5内含子的剪接比例,找到了可能调控第5内含子剪接的ISS、ISE和剪接蛋白MBNL1,初步阐明了高温调控Kdm6bb第5内含子剪接的分子机制。