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多酚氧化酶是催化褐变的关键酶,而褐变是双孢蘑菇采后对商品品质影响最大的品质劣变之一。克隆双孢蘑菇褐变相关基因,是实现蘑菇抗褐变定向育种的一项重要的基础研究工作。本研究用双孢蘑菇2796为试样,采用RT-PCR、RACE法克隆了来自于双孢蘑菇子实体褐化相关的PPO基因,并使其在大肠杆菌中做表达。对其基因进行同源性比较和序列分析。论文包括了三部分实验：(1)双孢蘑菇多酚氧化酶PPO基因的克隆及氨基酸序列测定：设计codehop引物克隆了PPO基因cDNA片段,并根据获得的序列信息,用cDNA末端快速扩增(RACE)方法从双孢蘑菇中克隆到了两个PPO同源基因的cDNA全长,将其命名为AbPPO3和AbPPO4,核酸长度分别为1.88kb和2.023kb,分别编码576和611个氨基酸,具有多酚氧化酶的Cu结合保守结构域。同源性分析表明,AbPPO3编码的氨基酸序列与其他真菌PPO同源蛋白的相似性约为21.50%；AbPPO4与其他真菌PPO蛋白的相似性约为20-63%。系统进化分析表明,AbPPO3和AbPPO4和已克隆的双孢蘑菇AbPPO2具有较近的进化关系。(2)多酚氧化酶基因表达的半定量RT-PCR分析：用半定量RT-PCR法,以18s rRNA基因作为内参照,研究双孢蘑菇褐变相关基因PPO mRNA的表达水平。分析结果表明,在双孢蘑菇子实体的不同发育时期,AbPPO3在针头期(pin head stage)表达量很低,在茶杯期(cup stage)至大开伞期(flat2 stage)表达量均较高。AbPPO4在针头期(pin head stage)到大开伞期(flat2 stage)表达量逐渐增强。双孢蘑菇4℃储藏时,AbPPO3和AbPPO4在第1天可检测到微量表达,第2～4天表达均较强,之后至第7天表达量下降。(3)多酚氧化酶PPO基因在大肠杆菌中的表达：将PPO构建到pET28a(+)上,转入E.coli BL21 (DE3)获得重组菌株,使用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导PPO蛋白的表达,应用SDS-PAGE分析目的蛋白,得到了分子量约为67KDa的特异表达条带,与表达产物的理论值相符。