【背景和目的】中枢神经系统疾病发病率逐年上升,难以治愈,影响生命质量。就脑卒中而言,我国每年新发脑卒中人数200余万人,呈现高发病率、高致残率和高死亡率的特点。幸存者中75%以上都会因为不同程度的神经损伤而留下后遗症。此外,我国已经进入老龄化社会,经济和医疗水平的提升大大延长了寿命,但随之而来的是神经退行性疾病发病率呈上升趋势。这些疾病严重影响患者及其家庭生活质量,也给社会带来了沉重的经济负担。神经元损伤是脑卒中和神经退行性疾病常见的病理特征;随着神经损伤的加重,患者的病情也随之恶化,面临着永久残疾甚至是死亡的威胁。因此,探究神经损伤分子机制,寻找具有神经保护作用的药物靶点意义重大。雌激素是一种类固醇激素,除了在发育、生长、生殖功能方面的作用外,还具有神经保护作用。雌激素的作用由经典的核受体(ERα、ERβ)和膜性受体(GPR30、Gaq-ER、ER-X)所介导。G蛋白偶联受体30(G protein-coupled receptor 30,GPR30)是上世纪90年代发现的一种新型雌激素膜受体。与经典的雌激素核受体不同,GPR30能够介导雌激素的快速反应和转录调节。我们前期的研究发现,神经元GPR30对N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)引起的兴奋性毒性具有良好的神经保护作用。星形胶质细胞(astrocyte,AS)是大脑中分布最广泛也是胶质细胞中体积最大的细胞。随着对AS研究的不断深入,发现AS在生理情况下支持、营养、保护神经元,而在应激创伤情况下,AS会发生反应性增生,释放炎症因子,产生细胞毒性作用,从而损伤神经元。脑中特定部位的AS增生导致神经元丢失与神经退行性疾病密切相关。研究表明:应激抑制了AS自噬从而引起AS反应性增生,损害了共培养神经元的活性。激活星形胶质细胞GPR30能够增强谷氨酸转运体EAAT1(GLAST)和EAAT2(GLT-1)的表达,从而促进其对谷氨酸的吸收。大豆中的主要成分异黄酮雌马酚能够激活GPR30缓解脂多糖诱导的AS炎性反应。但是,星形胶质细胞GPR30是否通过调控自噬参与神经保护作用尚不明确。本研究建立GPR30全敲、神经元和星形胶质细胞条件性GPR30敲除小鼠的中脑动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)缺血再灌损伤模型,探究了星形胶质细胞GPR30在神经保护中的作用。利用原代AS培养,探究星形胶质细胞GPR30调控自噬发挥神经保护作用的分子机制。【方法】1.利用CRISPR cas9和Cre/LoxP重组酶系统分别建立GPR30全敲小鼠(△3102),神经元GPR30条件性敲除小鼠(NSE-Cre flox/flox,NSE-Cre)和星形胶质细胞GPR30条件性敲除小鼠(GFAP-Cre flox/flox,GFAP-Cre),并利用PCR和基因组测序进行鉴定。2.建立MCAO模型,给予野生型和转基因小鼠GPR30激动剂G1治疗,进行行为学评分,探究星形胶质细胞GPR30的神经保护作用。3.利用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色方法检测野生型和转基因小鼠在接受MCAO手术和G1治疗后脑缺血体积的变化。4.野生型和转基因小鼠在接受MCAO手术和G1治疗后,制备冰冻脑切片,利用尼氏染色观察缺血区域神经元形态学变化。5.培养原代AS,利用免疫荧光染色鉴定细胞纯度,并给予谷氨酸(Glutamate,Glu)处理,体外模拟脑卒中后兴奋性毒性损伤。6.利用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)检测Glu、G1和/或G15处理后AS活性和增殖的变化。7.利用BrdU掺入实验进一步证实Glu、G1和/或G15处理后AS增殖的变化。8.原代培养AS,收集Glu、G1和/或G15处理后的AS培养液作为条件培养液(Astrocyte-conditioned medium,ACM)用于神经元的培养,并用MTT方法检测ACM条件培养液对神经元活性变化的作用。9.利用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测Glu、G1和/或G15处理后AS培养液中肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α),白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白介素6(Interleukin-6,IL-6)的水平。10.采用Western blot检测Glu、G1和/或G15处理后AS中相关蛋白表达量的变化。11.采用免疫荧光染色观察Glu、G1和/或G15处理后AS内自噬体数量的变化。12.采用单丹磺酰尸胺(Monodansylcadaverine,MDC)染色观察Glu、G1和/或G15处理后AS内酸性自噬溶酶体数量的变化。【结果】1.GPR30转基因小鼠的构建、繁殖和鉴定基因组PCR、RT-PCR和基因组测序结果验证了GPR30全敲小鼠、神经元GPR30条件性敲除小鼠和星形胶质细胞GPR30条件性敲除小鼠已经成功构建。2.在体发现星形胶质细胞GPR30参与神经保护作用建立MCAO模型,发现GPR30激动剂G1的神经保护作用在GPR30全敲小鼠中完全消失,在神经元或星形胶质细胞GPR30条件性敲除小鼠中部分消除。3.激动星形胶质细胞GPR30能够抑制Glu引起的AS反应性增生体外培养AS,MTT实验结果显示给予Glu处理能够引起AS活性增强,并呈现浓度(100,300,500μM)和时间(15,30,60,120 min)依赖性。MTT和BrdU掺入实验表明:G1(1,10 nM)预处理可以抑制Glu(300μM,30 min)引起的AS反应性增生,且这种作用能够被GPR30特异性抑制剂G15(100 nM)所阻断。Western blot和免疫荧光染色结果显示G1(1 nM)能够逆转Glu(300μM,30 min)引起的GFAP表达量的增加和纤维性AS数目的减少。4.激活星形胶质细胞GPR30能够抑制Glu引起的AS炎症因子释放体外培养AS,G1(1 nM)能够抑制Glu引起的AS释放TNF-α和IL-6,G1的作用能够被G15(100 nM)所阻断。将原代培养的神经元培养液更换为经Glu处理后的星形胶质细胞条件培养液(ACM),神经元活性受损;G1(1 nM)预处理的ACM没有损害原代培养的神经元。5.Glu引起的AS反应性增生与自噬抑制相关体外培养AS,不同浓度(100,300,500μM)和时间(15,30,60,120 min)的Glu处理能够降低AS中LC3-II/I比例和Beclin-1蛋白水平,并增加p62蛋白水平。Bafilomycin A1(Baf A1)是囊泡型H~+-ATP酶的抑制剂,能够阻断自噬-溶酶体融合并预防LC3-II降解。Baf A1的存在没有改变Glu对AS自噬的抑制。6.激活星形胶质细胞GPR30能够逆转Glu引起的AS自噬失衡体外培养AS,G1(1 nM)预处理逆转了Glu引起的LC3-II/I比例降低,且这种作用能够被G15(100 nM)阻断。LC3免疫荧光染色和MDC染色结果进一步证实了G1(1 nM)能够重建正常的自噬水平。7.AKT/mTOR信号通路没有参与星形胶质细胞GPR30介导的自噬平衡体外培养AS,Western blot结果显示Glu(300μM,30 min)能够增加p-AKT,p-mTOR以及下游的p-p70和p-S6RP的表达,但是G1(1 nM)预处理则不能抑制这些升高的蛋白磷酸化水平;Glu、G1和G15在短时间内没有影响AKT、TOR、p70和S6RP的总蛋白水平。8.ERK或JNK信号通路没有参与星形胶质细胞GPR30介导的自噬平衡体外培养AS,Glu(300μM,30 min)能够增加ERK和JNK的磷酸化水平,但是G1(1 nM)预处理则不能降低两种蛋白的磷酸化水平;同样总的ERK和JNK蛋白水平不受Glu、G1和G15影响。9.星形胶质细胞GPR30介导的自噬平衡通过p38 MAPK信号通路调控体外培养AS,Glu(300μM,30 min)降低了p38的磷酸化水平,G1(1 nM)预处理能够恢复其正常磷酸化水平,但不影响p38总蛋白水平。G1(1 nM)对p-p38和自噬的调控作用能够被p38的两种拮抗剂SB203580(SB,10μM)和LY2228820(LY,20μM)所阻断。同时,G1(1 nM)抑制AS激活和保护神经元的作用也能够被LY所取消。【结论】1.在体内实验中,星形胶质细胞GPR30参与小鼠MCAO缺血再灌注损伤的神经保护作用;2.在体外实验中,激活星形胶质细胞GPR30能够抑制兴奋性毒性损伤引起的AS反应性增生和炎症因子的释放;3.兴奋毒性通过抑制AS自噬引起AS反应性增生从而导致炎症因子释放增加,星形胶质细胞GPR30的神经保护作用与诱导AS保护性自噬相关;4.星形胶质细胞GPR30通过p38 MAPK信号通路重建自噬,产生神经保护作用。