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目的鲍曼不动杆菌己成为医院内感染的重要条件致病菌之一,其生物膜(Biofilm)作为主要的毒力因子,参与了鲍曼不动杆菌的粘附、耐药、应对环境变化、免疫逃逸等多个方面。本研究旨在探索鲍曼不动杆菌生物膜形成在临床分离株耐药中的作用,从而为制定预防和治疗鲍曼不动杆菌引起的医院感染的措施提供理论依据。方法美国MicroScan WalkAway全自动细菌鉴定及药敏分析仪进行临床分离鲍曼不动杆菌的鉴定与耐药谱检测；LB培养液培养鲍曼不动杆菌,测定生长曲线以确定其对数期,后续工作均采用对数期生长的细菌进行实验；采用96孔板培养法模拟细菌生物膜在体内的生长,结晶紫染色法测定各菌株生物膜形成能力；通过鲍曼不动杆菌在黑色聚碳酸酯膜上形成生物膜,生物膜上覆盖硝酸纤维素膜与氯霉素和氧氟沙星的药敏纸片,组成“三明治”结构(即黑色聚碳酸酯膜-生物膜-药敏纸片),将此结构置于涂有大肠埃希菌ATCC25922菌株的M-H平板上,以检测生物膜对氯霉素和氧氟沙星的渗透限制作用：针对时药谱中不同种类抗生素选取相应的四种耐药基因.即β-内酰胺酶基医TEM、碳青霉烯酶基因OXA-23、氯霉素乙酰转移酶基因cat和外排泵编码基因adeB。应用PCR与荧光定量PCR技术检测以上四种耐药基因在各菌株中的存在情况及其在细菌游离态和生物膜状态的表达差异。结果临床分离的7株鲍曼不动杆菌(编号为1、2、10、65、67、78、85)经检测均为多重耐药菌株(multi-drug resistance,MDR)结晶紫染色检测各菌株均能于体外形成生物膜,其中2号菌株的生物膜形成能力较弱,而10、65、67、78号菌株较强,1号与85号菌株生物膜形成能力居中。建立的黑色聚碳酸酯膜模型检测各菌株生物膜对氯霉素和氧氟沙星的渗透限制作用,结果显示,除85号菌株外,其余各菌株与对照组相比,对氯霉素均有明显的渗透限制作用,而对氧氟沙星则无明显作用。应用PCR技术检测了cat、OXA-23、TEM、adeB四种耐药基因在各菌株中的存在情况,结果显示TEM基因和cat基因普遍存在于耐药菌株中：外排泵基因adeB在67、78号菌株中均呈阳性；针对亚胺培南的耐药基因OXA-23仅存在于对亚胺培南耐药的67、78号菌株中。应用实时荧光定量PCR技术检测了65号、10号菌株TEM基因、cat基因在游离态细菌和生物膜状态细菌中的表达差异,结果显示,该基因在生物膜状态的表达明显低于游离态细菌；检测了67号、78号菌株TEM基因、adeB基因、OXA-23基因、cat基因在游离态细菌和生物膜状态细菌的表达差异,四种耐药基因在生物膜状态的表达均低于游离态。结论本研究中临床分离所得鲍曼不动杆菌均为多重耐药菌株,所选抗生素中敏感率以舒普深(头孢哌酮/舒巴坦钠)与亚胺培南最高。96孔板培养法可以很好的模拟细菌生物膜的生长,临床分离菌株均能于体外形成生物膜,但生物膜形成能力有差异。结晶紫染色可以有效的检测鲍曼不动杆菌生物膜形成能力。建立的“三明治”模型,即黑色聚碳酸酯膜-生物膜-药敏纸片方法,可用于检测生物膜形成对药物的渗透限制作用。本实验检测了氯霉素和氧氟沙星两种抗生素,结果显示,生物膜形成对氯霉素的渗透有限制作用,而对氧氟沙星则无此作用,表明渗透限制是生物膜对某些抗生素耐药的机制之一,但不能完全解释所有生物膜耐药现象。TEM基因、cat基因在临床分离鲍曼不动杆菌菌株中普遍存在,介导对β-内酰胺类、氯霉素类抗生素的耐药：OXA-23基因存在于对亚胺培南耐药的菌株中；adeB外排泵基因的存在也是导致鲍曼不动杆菌耐药的重要原因之一。实时荧光定量PCR结果显示,TEM、adeB、OXA-23、cat四种耐药基因在生物膜状态的表达明显低于游离态细菌,提示鲍曼不动杆菌生物膜耐药可能与这四种耐药基因的表达差异无直接关系,其机制尚有待研究。