黄檗组织培养及转基因体系的建立

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黄檗具有重要的经济和药用价值,由于黄檗的育苗条件要求较高,技术难度大,移栽成活率低,生长缓慢,成材年限长,因此在引种栽培上尚未大面积推广,野生资源缺乏,且目前存在自然更新困难、干形不通直、人工林种子败育等问题。本研究针对黄檗现有问题,利用黄檗成熟合子胚建立了黄檗的快速高效的组培体系和转基因体系,为黄檗优良品种的开发奠定了基础。1.组织培养方面的研究表明:黄檗种子在6-BA和NAA作用下愈伤组织发生的最早,28℃条件下添加4.0 mg·L-1TDZ和0.2 mg·L-1NAA的培养基中不定芽诱导率最高,为92.93%,平均诱导的不定芽个数最多,为25.03。最有利于黄檗不定芽生长的基本培养基配比为添加2%蔗糖的1/2 MS培养基。添加4.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA的培养基对不定芽的伸长生长最有效,两周净生长量达到3.75 cm。添加1.0 mg·L-1 IBA的培养基中不定芽根的诱导率最高,达到85%。添加1.0 mg·L-1 2,4-D或添加4.0 mg·L-1TDZ和0.2 mg·L-1NAA的培养基中诱导出体细胞胚,诱导率分别为16.67%、1.22%和32.26%和2.02%。黄檗的胚乳在添加4.0 mg·L-1BA和0.2 mg·L-1NAA的培养基中诱导出一棵不定芽。2.黄檗转基因体系建立的研究表明:侵染时将种子纵切成两半的方法既有利于农杆菌的侵染,又能获得较高的抗性芽诱导率。抗性芽诱导培养基中添加200 mg·L-1的头孢霉素和10 mg·L-1的卡那霉素。最佳的共培养时间为28℃2d+4℃2d,抗性芽诱导率达38.8%。共培养时期保留胚乳,共培养结束后清洗过程中剥离胚乳再转入抗性芽筛选培养基能获得更高效的抗性芽诱导率,并容易控制试验材料外部菌类的生长。抗性芽在增殖及伸长生长过程中,芽基部愈伤组织块切成约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm左右为宜。试验共获得70个转化子,进行DNA水平上的PCR,结果均为阳性。随机挑选其中的5个黄檗转基因植株进行PCR-southern检测,RNA水平上的RT-PCR检测,结果显示外源的LEA基因已经整合到黄檗的染色体基因组中,在转基因株系中已经转录为mRNA,获得了转基因植株。
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