第一部分内源性ghrelin、obestatin在急性胰腺炎患者临床过程中表达和意义的研究目的:观察内源性ghrelin、obestatin在急性胰腺炎(AP)患者早期临床过程中水平,分析其与AP不同严重程度、病因及临床特点的相关性。评价内源性ghrelin、obestatin在AP早期是否对AP严重程度有一定预测价值。方法:以193例AP患者作为观察组,24例健康人作为对照组。AP患者分成轻症急性胰腺炎(MAP)组、中度重症急性胰腺炎(MSAP)组、重症急性胰腺炎(SAP)组。收集患者入院后第一天(D1)、第三天(D3)、第五天(D5)及健康成人血清样本进行ghrelin、obestatin检测。对患者入院后第一天的临床资料、ghrelin、obestatin浓度按照病因以及AP严重程度分类进行分析比较。用受试者工作曲线(ROC)评价患者入院第一天ghrelin、obestatin浓度对AP严重程度的预测价值。结果:1.193例AP患者中MAP有94例(48.70%)、MSAP有70例(36.27%)、SAP有29例(15.03%)。按照病因分类,胆源性有67例(34.72%),酒精相关性有61例(31.6%),高甘油三脂血症有25例(12.95%),其他或不明病因有40例(20.75%);MAP在胆源性组、酒精相关性组、高甘油三脂血症组及其他病因组所占比例分别是59.7%、45.9%、20%、52.5%;2.实验室指标分析,甘油三酯在SAP组较MAP组、MSAP组均明显增高(P<0.05)。甘油三酯在高甘油三酯血症组较其余三组均明显增高(P<0.01)。血白细胞(WBC)、中性粒细胞(N)、白蛋白(ALB)、血钙(Ca)水平在AP患者不同病因或不同严重程度组间没有明显差异。Ranson评分在SAP组较MAP组、MSAP组均明显增高(P<0.05)。MCTSI评分在MAP组均较MSAP组、SAP组明显降低(P<0.01)。BISAP评分在SAP组较MAP组明显增高(P<0.05)。BISAP评分在高甘油三脂血症组较其他病因或不明病因组明显增高(P<0.05);3.血清ghrelin水平在MAP组、MSAP组、SAP组随着住院时间逐渐增高,D1与健康对照组相比,AP三组均明显降低(P<0.01)。D1血清ghrelin水平AP患者组间比较,MAP组较MSAP组、SAP组均显著增高(P<0.05,P<0.01)。D3血清ghrelin水平MAP组较SAP组显著增高(P<0.01)。D5SAP组较MSAP组、MAP均显著增高(P<0.05,P<0.01);4.D1、D3、D5血清obestatin水平变化无差异,D1与健康对照组相比,AP三组均无明显差异,AP组间比较也无差异,高甘油三脂血症AP组obestatin比健康对照组明显降低(P<0.001)。D3、D5obestatin组间也无明显差异;5.D1Obestatin水平在高甘油三酯血症组较酒精相关性组及其他组均明显降低(P<0.05),而较胆源性组降低最明显(P<0.01)。ghrelin水平在各病因组间无明显差异;6.AP患者入院D1血清ghrelin和obestatin水平分析,仅ghrelin对胰腺炎严重程度能有一定预测价值,AUC=0.646,而obestatin没有预测价值。Logistics二元回归分析ghrelin数据,结果显示:在ghrelin<87.83pg/ml时,Non-MAP的发生概率更高,OR为10.94,95%CI为[5.082-23.549]。结论:1.高甘油三脂血症AP患者病情更倾向发展为重症;2.AP早期患者血清ghrelin水平降低与AP严重程度相关。2.早期ghrelin水平对预测非MAP患者严重程度有一定预测价值;3.血清obestatin在高甘油三脂血症性AP患者较其他病因AP更有意义。第二部分急性胰腺炎大鼠内源性ghrelin、obestatin的表达及IKKβ/NF-κB通路状态目的:观察SAP、MAP大鼠模型血清ghrelin、obestatin的水平以及IKKβ/NF-κB信号通路情况。方法:32只雄性SD大鼠随机分为四组:SAP组(n=8);假手术对照组(C-S组,n=8);MAP组(n=8);注射生理盐水组(C-M组,n=8)。SAP组采用逆行胰胆管注射4%牛磺胆酸钠溶液建立急性坏死性胰腺炎模型;C-S组仅翻动胰腺及部分肠管;MAP组腹腔注射雨蛙肽建立急性水肿性胰腺炎模型;C-M组腹腔注射等量生理盐水。实验大鼠均在造模后24小时处死并解剖。完成胰腺病理学评分;免疫组化法检测胰腺组织p-p65、p-IKKβ蛋白的表达;自动生化仪检测血清淀粉酶浓度;ELISA法测定血清TNF-α、IL-1β、ghrelin及obestatin水平。结果:1.胰腺组织病理评分、血清淀粉酶、TNF-α与IL-1β浓度在SAP组较C-S组及MAP组均明显增高(P<0.05),胰腺组织病理评分、血清AMS、TNF-α、IL-1β在MAP组较C-M组也均明显升高(P<0.05);2.血清ghrelin浓度SAP组较C-S组、MAP组均明显增高(P<0.05),MAP组较C-M组无差异;3.血清obestatin的浓度组间比较,MAP组与对照组无差异,SAP组较C-S组、MAP组均显著降低(P<0.05);4.胰腺组织p-p65、p-IKKβ蛋白MAP组、SAP组表达量均较对照组明显增高(P<0.05),而且SAP组也高于MAP组(P<0.05)。结论:1.在大鼠AP模型中,内源性ghrelin和obestatin浓度和炎症的严重程度相关;2.在大鼠AP模型中,炎症越重IKKβ/NF-κB信号通路激活越明显。第三部分调控ghrelin基因对急性胰腺炎细胞模型IKKβ/NF-κB通路的影响目的:观察内源性ghrelin、obestatin差异性表达对急性胰腺炎腺泡细胞模型中IKKβ/NF-κB通路的影响,从而评价其对AP的作用。方法:构建ghrelin、obestatin共有基因ghrelin的过表达和干扰载体,包装成慢病毒载体。分别将ghrelin基因过表达和干扰的慢病毒载体干扰大鼠胰腺腺泡AR42J细胞,将空载包装的慢病毒载体感染的AR42J细胞作为对照组。通过其荧光强度判断转染效率,同时进行q RT-PCR和Western blot进行验证,构建ghrelin干扰和过表达稳转AR42J细胞株。随后将细胞分成两组,一组ghrelin基因抑制实验组,包括ghrelin干扰稳转AR42J细胞(AR42J+ghrelin sh RNA)、空转染的AR42J细胞(NC)以及AR42J细胞。另一组为ghrelin基因过表达实验组,包括ghrelin过表达稳转AR42J细胞(AR42J+ghrelin)、空转染的AR42J细胞(NC)以及AR42J细胞。使用雨蛙肽诱导细胞构建AP细胞模型。Weston blot检测IKKβ/NF-κb通路蛋白p65、p-p65、IKKβ、p-IKKβ以及ghrelin蛋白表达情况,ELISA检测细胞上清中TNF-α、IL-1β水平及细胞裂解液中obestatin水平。结果1.q RT-PCR和WB结果分别证实ghrelin基因和ghrelin蛋白在过表达的AR42J细胞和干扰的AR42J细胞较NC细胞有明显的上调和下调(P<0.05)。而在AR42J细胞与NC细胞均无明显差异。ELISA显示细胞裂解液中的obestatin蛋白水平在ghrelin过表达稳转的细胞及ghrelin干扰稳转的较NC细胞均无明显差异。2.在ghrelin抑制实验组:IKKβ/NF-κb通路蛋白及ghrelin蛋白在NC细胞与AR42J细胞无论雨蛙肽是否干预其表达均无明显差异,所有蛋白在雨蛙肽干预后明显增高(P<0.05),IKKβ/NF-κB通路蛋白在ghrelin干扰细胞株无论雨蛙肽是否干预均比NC细胞表达明显增高(P<0.05)。Ghrelin蛋白在ghrelin干扰细胞株无论雨蛙肽是否干预均比NC细胞表达明显降低(P<0.05);obestatin水平在雨蛙肽干预组较未干预组无明显差异;TNF-α、IL-1β水平无论雨蛙肽是否干预在NC细胞和AR42J细胞均无明显差异,在ghrelin干扰细胞无论雨蛙肽是否干预较NC细胞均明显增高(P<0.05);3.在ghrelin过表达实验组:IKKβ/NF-κB通路蛋白及ghrelin蛋白在NC细胞与AR42J细胞无论雨蛙肽是否干预表达均无明显差异,所有蛋白在雨蛙肽干预后均明显增高(P<0.05),IKKβ/NF-κB通路蛋白在ghrelin过表达细胞无论雨蛙肽是否干预均比NC细胞表达明显降低(P<0.05),ghrelin蛋白在ghrelin过表达细胞无论雨蛙肽是否干预均比NC细胞表达明显增高(P<0.05);obestatin水平在雨蛙肽干预组较未干预组无明显差异;TNF-α、IL-1β水平无论雨蛙肽是否干预在NC细胞与AR42J细胞间均无明显差异,在ghrelin过表达细胞无论雨蛙肽是否干预较NC细胞均明显降低(P<0.05)。结论1.在AP腺泡细胞中抑制ghrelin表达增加了促炎症因子TNF-α、IL-1β的水平和IKKβ/NF-κB信号通路的活性;2.在AP腺泡细胞中ghrelin的过表达降低了促炎症因子TNF-α、IL-1β的水平和IKKβ/NF-κB信号通路的活性。