环肽是一类结构稳定,生物活性广泛的环状化合物,具有广泛的应用价值。特别是环形抗菌肽,具有对热稳定、抗菌谱广、分子量小、免疫原性低等特点,由于其杀菌机制独特、不易产生耐药性,有望开发成为新一代肽类抗生素。设计、改造和制备天然环肽,并进一步研究其作用机理,提高抗菌活性等显得尤为重要。而环肽制备常用的方法是化学合成法,该方法存在一定的局限性,如成本高、易形成多聚体副产物和环化步骤繁琐等。本研究利用断裂蛋白质内含子介导的蛋白质反式剪接技术进行环形抗菌肽的制备。该方法为酶学反应,可以在生理条件下发生,且所需分子浓度低。断裂蛋白质内含子是蛋白质内含子中的一种,能够自我催化介导蛋白质反式剪接而形成成熟的蛋白质。断裂蛋白质内含子剪接结构域分为N-端剪接结构域(I_N)与C-端剪接结构域(I_C),它们可以分别位于不同的编码阅读框。在蛋白质反式剪接中,N-端剪接结构域与C-端剪接结构域相互识别,通过非共价键相互作用,重建剪接活性中心,从而进行自我催化从前体蛋白质中切除下来,而两端的蛋白质外显子以新的肽键相连。因此多肽环化中,将目标多肽插入断裂蛋白质内含子的两端剪接结构域之间,通过反式剪接,使多肽首尾相连得以环化。本研究选用了AS-48、Garvicin ML、Butyrivibriocin AR10和Uberolysin四种细菌素,它们是一类由不同细菌产生的具有较强抗菌活性的天然环肽。同时选取了本课题组中经筛选后活性较高、通用性较好的两种新型断裂蛋白质内含子CPE和RB。首先采用PCR、重叠延伸PCR方法克隆构建了两种通用载体,分别在两种断裂蛋白质内含子的C-端剪接区域和N-端剪接区域中插入标签序列Flag作为连接子。随后,通过无缝克隆(不引入任何外源氨基酸),通用载体中的Flag序列分别被4种细菌素序列取代,使细菌素插在两端剪接区域之间,构建了8种重组表达质粒。经过对蛋白诱导表达条件的摸索,结果表明重组表达质粒中只有两种细菌素Butyrivibriocin AR10和Uberolysin在大肠杆菌中成功表达,其18℃表达时主要以可溶性形式存在于上清中,37℃表达时主要存在于沉淀中。通过分析发现重组蛋白中只有细菌素Uberolysin在RB的介导下成功发生剪接,但体内剪接率低,环肽分子量小,难以检测与纯化。在后续实验中,本文对不同温度诱导下的该重组蛋白采用了变性纯化与非变性纯化,对纯化后的蛋白进行体外剪接,发现其在体外基本不剪接。为了进一步验证Uberolysin的环化,对该重组蛋白进行了改造,引入了小分子蛋白标签C-Myc,通过SDS-PAGE、Tris-Tricine-SDS-PAGE和Western Blot等技术来检测环肽Uberolysin。初步结果显示,细菌素Uberolysin在断裂蛋白质内含子RB的介导下成功在大肠杆菌体内发生剪接并得以环化。后续可进一步通过HPLC及质谱鉴定环肽的存在。该方法为细菌素的制备提供了新的途径,也进一步为拓展环形抗菌肽的应用打下基础。