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在结构上影响肉剪切力值的主要成分为肌原纤维蛋白和结缔组织。目前,有关剪切力值的研究大多集中在肌原纤维的变化上,从结缔组织层面探讨牛肉剪切力值的研究较少。在动物生理成熟过程以及脂肪沉积过程中肌内结缔组织中成熟交联、蛋白多糖的变化是否会对结缔组织特性产生影响,进而影响牛肉剪切力值未见系统报道。组织蛋白酶对于肌纤维的降解存在争议,而其对结缔组织的弱化机制更是鲜有报道。有机酸可以弱化结缔组织,但作用机理未见系统报道。基于如上问题,本研究从胶原蛋白、成熟交联入手,探索了不同花纹等级和不同齿龄下结缔组织特性和剪切力值的关系;采用SDS-PAGE、Western-blot、扫描电镜、透射电镜、光镜、红外光谱、CD光谱、DSC技术,观察组织蛋白酶L和苹果酸处理对肌原纤维蛋白、结缔组织的弱化现象,具体研究内容如下。1.牛背最长肌肌内结缔组织中成熟交联、蛋白多糖、糖胺聚糖与结缔组织特性和剪切力值关系在齿龄相同情况下,随着牛背最长肌花纹等级的增加,肌内结缔组织中成熟交联含量、核心蛋白聚糖(decorin)和糖胺聚糖(GAGs)的含量逐渐降低,从而导致胶原蛋白性质发生变化,胶原蛋白的热溶解性升高,牛肉剪切力值降低。扫描电镜表明在肌内脂肪较多的牛背最长肌中胶原纤维分散成丝状,结构较松散。在花纹等级相同情况下,随着生理成熟度增加(0、1、2、3和4对永久门齿),肌内成熟交联含量、核心蛋白聚糖和糖胺聚糖的含量也随之增加,胶原蛋白热溶解性降低,剪切力值增大;胶原纤维排列紧密,呈片状或者簇状分布,结构紧密。多元统计结果表明,成熟交联含量、蛋白多糖和糖胺聚糖含量与结缔组织热溶解性显著负相关,与剪切力值显著正相关;牛肉剪切力值的大小首先取决于结缔组织中胶原蛋白的热溶解性、成熟交联、蛋白多糖和糖胺聚糖含量,其次取决于结缔组织中胶原蛋白的含量。2.组织蛋白酶L降解肌原纤维蛋白和结缔组织的研究通过酸化、硫酸按沉降、透析、浓缩、DEAE-Sephacel、Sephacryl S-100、SP Sepharose Fast Flow、Blue Sepharose Fast Flow 和 ConA Sepharose 4B 层析,纯化得到牛胰脏组织蛋白酶L,其分子量约为30 kDa,最适pH为5.5。SDS-PAGE显示,组织蛋白酶L可以水解肌球蛋白重链(MHC)、肌钙蛋白T、原肌球蛋白以及肌球蛋白轻链(MLC1);肌动蛋白、α-肌动素、肌间线蛋白、肌钙蛋白Ⅰ降解不明显。透射电镜研究发现,组织蛋白酶L主要破坏肌原纤维A带区域(主要是MHC),对于Z线及附近蛋白(肌动蛋白,骨架蛋白)降解能力较弱,这与钙激活酶的水解机制不同。圆二色谱研究表明,随着肌原纤维蛋白的水解,肌原纤维蛋白二级结构中α-螺旋结构的相对含量下降了13.2%,β-折叠含量增加了108.6%。组织蛋白酶L可使肌内结缔组织的热变性温度显著降低。未处理组初始变性温度To为60.63℃,在pH 5.0和pH 5.5的柠檬酸缓冲溶液中,其To值分别降低至57.87℃和59.73℃。在pH 5.0的酶处理组,经过36 h酶解处理后To值降低至41.41℃(P<0.05)。而在pH5.5的酶处理组,To值降低了3.16℃(P<0.05)。对于峰值变性温度Tp,在pH 5.0和36 h条件下,组织蛋白酶L使峰值变性温度Tp由65.38℃降低至43.79℃(P<0.05);而在pH 5.5、36 h处理组中,Tp降低至60.79℃(P>0.05)。这表明,pH越低,组织蛋白酶L对结缔组织降解作用越明显。SDS-PAGE表明组织蛋白酶L对胶原蛋白的水解位点不在α链的三螺旋区,而在端肽区。此外,组织蛋白酶L可以降解蛋白多糖,反应体系pH越低,组织蛋白酶水解效率越高。胶原蛋白端肽区和蛋白多糖的水解共同改变了结缔组织的性质,从而影响牛肉的剪切力值。3.苹果酸影响牛肉肌内结缔组织性质及其嫩化牛肉研究苹果酸可降低牛背最长肌剪切力值和肌内胶原蛋白的含量。苹果酸处理24 h后,肌内胶原蛋白含量由空白组中4.7mg/g逐渐降低至3.5 mg/g,热溶解性由空白组的17%上升至24%。组织学观察表明,酸处理使得初级肌束膜和次级肌束膜的厚度都有所减小,24h后,初级肌束膜发生一定程度破坏。与此同时,结缔组织的初始变性温度和峰值变性温度(TO和TP)均显著降低,分别由未处理组的60.63℃和65.38℃降低至37.55℃和40.15℃(P<0.05)。苹果酸使结缔组织中的蛋白多糖逐步解离。衰减全反射-傅里叶红外光谱(ATR-FTIR)结果表明,酸处理后胶原蛋白二级结构变化不明显,仅310-螺旋、反向聚集片与β-转角结构发生较小转化;这可能与核心蛋白聚糖的解离有关。胶原蛋白"热稳定区"的构象发生局部转变,使得胶原蛋白三螺旋链更易发生解旋,胶原蛋白更容易发生热变性。