研究目的胰岛素抵抗是多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome,PCOS）重要特征。外周组织中过多的皮质醇及IL-1β会导致胰岛素靶向器官的胰岛素抵抗,但目前并未有研究探索卵巢局部的皮质醇以及IL-1β在PCOS卵巢颗粒细胞胰岛素抵抗中的作用。因此本研究探索了卵巢局部皮质醇及炎症因子IL-1β对卵巢颗粒细胞的胰岛素抵抗以及卵巢颗粒细胞功能的调控作用及其两者的关系。研究方法1.根据鹿特丹诊断标准将患者分为PCOS组和非PCOS组【单纯管性因素不孕,正常BMI未合并胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）】,其中PCOS组根据空腹胰岛素水平以及HOMA-IR分为PCOS合并IR组和PCOS未合并IR组（其中空腹胰岛素≥15 uIU/ml和或HOMA-IR≥2.0者为PCOS合并IR组,不满足以上条件者为PCOS未合并IR组）,收集各组患者取卵后的卵泡液和颗粒细胞;2.采用免疫检测试剂盒检测卵泡液和培养液中的皮质醇、可的松、IL-1β、乳酸、E₂、P₄水平;3.采用免疫荧光、PCR、Western blot以及酶亲和力实验技术明确11β-HSD1、11β-HSD2在卵巢颗粒细胞的定位、表达以及活性;4.采用实时定量PCR方法检测三组未培养的卵巢颗粒细胞中11β-HSD1、11β-HSD2、GR-α、IL-1β、PTEN和GLUT4 mRNA的表达;5.来自于三组患者的颗粒细胞体外培养三天后,加入1μM皮质醇或者可的松作为底物,分别检测三组颗粒细胞11β-HSD的还原酶和氧化酶活性;6.原代颗粒细胞培养添加浓度梯度的皮质醇（0,0.1,1μM）、IL-1β（0,0.1,1,10 ng/ml）和皮质醇（1μM）联合IL-1β（0.1 ng/ml）处理细胞24小时,采用实时定量PCR、Western blot和ELISA方法探索其对卵巢颗粒细胞11β-HSD1和11β-HSD2的表达和活性、胰岛素抵抗相关基因改变（PTEN,Akt磷酸化,GLUT4转位等）、孕激素合成关键酶（StAR,CYP11A1,3β-HSD）表达及孕激素合成的影响。研究结果1.三组临床资料显示PCOS合并IR组BMI、空腹胰岛素水平、HOMA-IR水平以及高敏CRP显著高于PCOS未合并IR组和非PCOS组。PCOS合并IR组hCG日E₂水平/获卵数、卵泡液中P₄和乳酸水平显著低于其他两组,并且PCOS合并IR组的优胚率显著低于非PCOS组,提示PCOS合并IR患者卵巢局部存在的胰岛素抵抗可能会影响激素合成和胚胎质量。2.卵泡液中皮质醇的水平约为可的松的10倍。PCOS合并IR组卵泡液中皮质醇的水平显著高于PCOS未合并IR组和非PCOS组,而三组可的松的水平无显著差异。3.PCOS合并IR组卵泡液中的IL-1β水平显著高于非PCOS组。并且卵泡液中的IL-1β水平与血清CRP水平、空腹胰岛素水平和HOMA-IR水平成正相关,而与卵泡液中的乳酸水平成负相关,提示卵巢局部的IL-1β水平与全身炎症状态、全身胰岛素抵抗和卵巢局部胰岛素抵抗均密切相关4.免疫荧光技术、PCR以及Western免疫印迹技术显示11β-HSD1与11β-HSD2在黄素化卵巢颗粒细胞中均可表达。酶亲和力实验表明11β-HSD还原酶的K_m平均值是242.3±69.6 nM,符合11β-HSD1的特征;11β-HSD氧化酶的K_m平均值是540±42.4 nM,符合11β-HSD2的特征,提示我们获得的黄素化颗粒细胞既可表达11β-HSD1又可表达11β-HSD2。5.PCOS合并IR组11β-HSD1 mRNA表达显著高于PCOS未合并IR组和非PCOS组,而GR-α和11β-HSD2 mRNA的水平三组无显著差异。卵泡液中皮质醇的水平与卵巢颗粒细胞11β-HSD1 mRNA水平成正相关,而与11β-HSD2无相关性。PCOS合并IR组11β-HSD1还原酶的活性显著高于其他两组,而11β-HSD氧化酶的活性显著低于其他两组。6.体外添加皮质醇可以浓度依赖性的促进颗粒细胞（来自于非PCOS人群）11β-HSD1表达,同时也会促进可的松转换为皮质醇的比例（11β-HSD1还原酶的活性）。而相同浓度的皮质醇对卵巢颗粒细胞11β-HSD2 mRNA的表达无影响。同时皮质醇可以浓度依赖性的促进来自于PCOS人群体外培养的卵巢颗粒细胞11β-HSD1表达。7.PCOS合并IR组颗粒细胞PTEN mRNA表达是PCOS未合并IR组和非PCOS组的2倍,并且颗粒细胞PTEN mRNA的表达与卵泡液皮质醇和IL-1β的浓度以及颗粒细胞11β-HSD1mRNA表达成正相关。体外实验进一步证明皮质醇和IL-1β分别处理均可以促进颗粒细胞PTEN表达。皮质醇和IL-1β分别预处理24小时后均可降低颗粒细胞胰岛素激活的Akt磷酸化和GLUT4转位。8.皮质醇能够抑制颗粒细胞StAR表达和孕激素的合成,而IL-1β可促进颗粒细胞StAR表达和孕激素的合成。9.皮质醇（1μM）和IL-1β（0.1 ng/ml）共同处理并不会进一步促进或削弱单独皮质醇或IL-1β对颗粒细胞PTEN表达、Akt磷酸化以及GLUT4转位的作用。而对于StAR表达和孕酮合成,皮质醇完全抑制了IL-1β对颗粒细胞StAR表达和孕酮合成的促进作用。研究结论颗粒细胞11β-HSD1表达及还原酶的活性增加是PCOS合并胰岛素抵抗患者卵泡液中皮质醇增加的主要原因。卵巢局部过多的皮质醇和IL-1β可能会通过促进颗粒细胞PTEN表达而降低胰岛素激活的Akt磷酸化和GLUT4转位,最终导致PCOS患者颗粒细胞的胰岛素抵抗。但皮质醇和IL-1β共同作用并不会进一步促进或者削弱单独的皮质醇或者IL1-β的对颗粒细胞胰岛素抵抗的调控作用。PCOS合并胰岛素抵抗患者卵巢局部孕酮降低可能与局部过多的皮质醇抑制了颗粒细胞StAR的表达相关。