第一部分二尖瓣病变合并房颤模型猪左心房流场中湍流切应力对其病变作用机制的研究[目的]分别建立二尖瓣狭窄、二尖瓣关闭不全、单纯房颤及瓣膜性房颤的动物模型,明确各模型猪左心房流场中湍流切应力(Turbulent Shear Stress,TSS)及流场均匀性与左心房组织病理变化的关系。为进一步研究TSS致左心房组织损伤的分子生物学奠定基础。[方法]1、采用滇南小耳猪,随机分组方案,分别建立二尖瓣狭窄、二尖瓣关闭不全、单纯房颤以及二尖瓣狭窄并房颤、二尖瓣关闭不全并房颤的动物模型,以及正常对照组,每组5只(n=5),进行1年的动态观察监测。分别于建模前、术后即刻、术后1个月、6个月、12个月对各组动物进行超声心动图检查,分别检测常规多普勒指标(RFMV、LAD、LAAD、LAEF、LAAEF);流场均匀性指标(MVA、MVRv、PVVmean、LAAVmean、Vmax、△Vmax):采用超声多普勒检测联合计算机辅助成像,通过流体力学的计算,得出湍流切应力(TSS)的具体数值。经统计学分析,比较各组与对照组之间的差异。2、在建模后12月完成超声心动图检测后,将所有动物处死,取猪肺静脉开口、左心耳、房间隔、二尖瓣、乳头肌等部位的组织,用中性福尔马林固定,制成石蜡并包埋切片,经HE染色和Masson染色后,在光镜下进行左心房病理情况的观察。剪左心房组织匀浆,采用Real-TimePCR技术,检测KCa2.3/3.1在左心房组织的mRNA表达情况;采用WesternBlot技术,检测KCa2.3/3.1在左心房组织蛋白的表达情况。经统计学分析,与正常对照组及单纯AF动物模型组对比观察。[结果]1、各模型制作顺利,其中MR组、MS+AF组、MR+AF组在术中各死亡1例,AF组建模后观察过程中死亡1例。2、建模后评价指标的比较:对照组手术前后各指标对比均无统计学差异(P>0.05);各模型组的建模后评价指标与建模前比较,差异有统计学意义(P<0.05);其中AF组及瓣膜性AF组建模后呈现典型的AF心电图表现。3、常规多普勒指标、流场均匀性及TSS与对照组比较结果:各模型组建模后LAD、LAAD、LAEF、LAAEF指标变化与对照组比较具有统计学差异(P<0.05),并且与相应疾病的超声心动图特点相符;MS和MS+AF组的MVA、MR和MR+AF组的MVRV在建模后即刻出现变化,随观察时间延长,逐渐增大(P<0.05);其余指标PVVmean、LAAVmean、Vmax、△Vmax 均于建模后 6m开始出现明显变化,左心房内流场均匀性明显变差;各模型组与对照组Lc核心区位点TSS比较无差异(P>0.05),而Lm和L1位点均较对照组TSS明显升高,有显著性差异(P<0.01)。4、常规多普勒指标、流场均匀性及TSS在各组间比较结果:各模型组LAD、LAAD、LAEF、LAAEF检测指标在建模后即刻、建模后1m两两比较,差异无统计学意义(P>0.05),在建模后6m、建模后12m上述指标两两比较,差异有统计学意义(P<0.05);各模型组PVVmean、LAAVmean、Vmax、△Vmax检测指标在建模后即刻、建模后1m两两比较,差异无统计学意义(P>0.05),在建模后6m、建模后12m上述指标两两比较,差异有统计学意义(P<0.05);其中,MS+AF组建模后6m、12m时间点的各项指标与其他组比较,有显著性差异(P<0.01);各模型组Lc位点的TSS值在建模后与建模前比较,以及建模后各时间点两两比较,差异无统计学意义(P>0.05);各模型组Lm、L1位点的TSS值在建模后即刻、建模后1m两两比较,差异无统计学意义(P>0.05),在建模后6m、建模后12m上述指标两两比较,差异有统计学意义(P<0.05);其中,MS+AF组建模后12m时间点Lm、L1位点的TSS值与其他组比较,有显著性差异(P<0.01)。5、左心房心肌组织切片HE染色结果:MS、MR、AF、MS+AF和MR+AF组较正常组的心肌细胞粗大、排列更加紊乱、细胞水肿,并有空泡现象,伴有结缔组织增多;MS+AF与MR+AF组上述病理表现更加突出,尤以MS+AF组更甚,空泡多而大,胞核受压浓集中于边缘,大量纤维增生包绕心肌细胞,丰富而致密。Masson染色结果提示:MS、MR、AF组较对照组胶原纤维增多;尤其是MS+AF和MR+AF组上述病理表现更加突出,大量胶原纤维增生,包绕心肌细胞,致密而丰富。6、Real-time PCR和Western Blot结果显示:与正常对照组比较,各动物模型组不同部位KCa2.3、KCa3.1、AKT1、P300的mRNA和蛋白表达水平均有不同程度的升高(P<0.05),其中MS+AF组各指标变化最大(P<0.05),其次为MR+AF、AF 组(P<0.05),MS 和 MR 组 KCa2.3、AKT1、KCa/3.1、P300mRNA和蛋白表达水平虽有变化,但无统计学差异(P>0.05)。比较各组猪肺静脉开口、左心耳、房间隔、二尖瓣、乳头肌部位的KCa2.3、AKT1、KCa3.1、P300mRNA和蛋白表达水平,与正常组比较,各部位各指标的mRNA和蛋白表达均有所升高,其中,肺静脉开口处和左心耳各指标表达变化最显著(P<0.01);而肺静脉开口处较左心耳处各指标比较,差异有统计学意义(P<0.05),其次是房间隔、二尖瓣、乳头肌部位KCa2.3、AKT1、KCa/3.1、P300mRNA和蛋白表达水平与对照组比较也有所差异,但变化明显小于肺静脉开口(P<0.05),并且左心耳、房间隔部位互相比较差异并无统计学意义(P>0.05)。[结论](1)5种动物模型创建的方法科学可靠、可行性强、重复性好,对进一步研究瓣膜病变以及瓣膜性房颤的异常血流动力学奠定基础。(2)左心房流场中湍流切应力的增高是导致左心房重构的重要因素之一。(3)KCa2.3/3.1在不同部位心肌组织中的表达分布有差异,其中在肺静脉开口处表达最高,其次左心耳=房间隔>二尖瓣>乳头肌。(4)KCa2.3/3.1及其相关基因在TSS导致二尖瓣病变持续损害及房颤形成的过程中起关键作用。(5)KCa2.3/3.1参与了 TSS对内皮细胞的信号转导。第二部分瓣膜性房颤患者左心房流场中切应力对其病变及血栓形成作用机制的研究[目的]用计算机技术模拟左心房流场和湍流切应力的变化,并比较单纯二尖瓣病变患者、瓣膜性AF患者与对照组心肌组织的病理差异,分析左心房流场与湍流切应力和左心房重构及血栓形成的相关性;通过比较KCa2.3/3.1通道蛋白及相关基因的表达差异,探究KCa2.3/3.1通道与瓣膜性AF及血栓形成的相关性。[方法]经伦理审核及知情同意的前提下,对需接受外科二尖瓣置换或二尖瓣成形治疗的患者75例,随机分为单纯二尖瓣病变各15例(MS、MR)、瓣膜性房颤各15例(MS+AF、MR+AF、MS+AF+血栓组),并设立对照组15例,用计算机技术模拟左心房流场和湍流切应力的变化,血栓弹力图仪评估患者血栓形成风险;多普勒超声检测左心房流速,在手术中取出患者房间隔靠近肺静脉开口处组织,采用HE和Masson染色检测病理改变;采用Real-Time PCR技术,检测KCa2.3/3.1的相关基因CKNN3/4在左心房组织的mRNA表达情况;采用WesternBlot技术,检测KCa2.3/3.1在左心房组织蛋白的表达情况;采用免疫荧光技术,检测KCa2.3/3.1在左心房组织中的表达水平。经统计学分析,比较各组与对照组之间的差异。[结果]1、血栓弹力图显示:R值和K值减少,Ma值和CI值增大在MS+AF+血栓组最显著(p<0.01),其次是MS+AF组、MS组(p<0.05),而MR+AF组和MR组之间无明显变化(p>0.05),但和对照组比较,差异有统计学意义(p<0.05)。2、HE染色结果显示:对照组细胞核呈蓝色,胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色。各疾病组较对照组的心肌细胞粗大、排列更加紊乱、细胞水肿,并有空泡现象,伴有结缔组织增多。且此现象从严重到轻微的顺序为MS+AF+血栓组、MS+AF组、MR+AF组、MS组,而MR组变化不明显;Masson染色结果显示:对照组胶原纤维呈现蓝色,心肌纤维呈现红色;MS+AF+血栓组、MR+AF、MS+AF组蓝色胶原纤维与对照组比较明显增加,且分布紊乱。MS+AF+血栓组尤为明显,大量胶原纤维增生,包绕心肌细胞,致密且丰富。此现象从严重到轻微的顺序为MS+AF+血栓组、MS+AF组、MR+AF组、MS组,而MR组视野中蓝色较少。3、Real-Time PCR结果显示:与对照组比较,各组KCCN3、KCNN4、AKT1和P300 mRNA表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),其中,MS+AF+血栓组和MS+AF组与对照组比较具有显著性差异(P<0.01)。KCCN3、KCNN4的mRNA表达在MS组与MR组之间比较、MS+AF组与MR+AF组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05),剩下其余各组之间两两比较,差异有统计学意义(P<0.05)。AKT1的mRNA表达在MS组与MS+AF组之间比较、MR组与MR+AF组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05),剩下其余各组之间两两比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。P300的mRNA表达在各组之间两两比较,除MS+AF+血栓组与各组之间比较差异有统计学意义(P<0.05)外,其余各组之间两两比较,差异无统计学意义(P>0.05)。4、westemblot结果显示:与对照组比较,各组KCa2.3/3.1、AKT1、P300的蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),其中,MS+AF+血栓组和MS+AF组与对照组比较具有显著性差异(P<0.01)。KCa2.3/3.1在MS组与MR组、MS+AF组与MR+AF组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05),MS+AF与MR+AF较MS、MR明显增高,即VAF患者较单纯二尖瓣病变患者心肌中KCa2.3/3.1通道蛋白表达增高。MS+AF+血栓组分别与MS+AF和MR+AF组比较,KCa2.3/3.1两通道蛋白在心肌中的表达差异有统计学意义(P<0.05),MS+AF+血栓组表达增高。AKT1的蛋白表达除了在MS+AF+血栓组与其他各组之间两两比较时,差异有统计学意义(P<0.05)外,其他各组之间两两比较差异无统计学意义(P>0.05);P300在各组间两两比较,其中MS与MR组比较,差异无统计学意义(P>0.05),其余各组两两比较,差异有统计学意义(P<0.05)5、免疫组化结果显示:心肌组织中,KCa2.3的表达高于KCa3.1。与对照组比较,各疾病组心肌中KCa2.3/3.1通道蛋白表达均较对照组增高,差异具有统计学意义(P<0.05);其中,VAF 患者(MS+AF,MR+AF,MS+AF+血栓组),尤其是合并血栓的VAF患者(MS+AF+血栓)KCa2.3/3.1通道蛋白表达增高最为明显,具有显著性差异(P<0.01)。而MS组与MR组之间、MS+AF组与MR+AF组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。6、左心房数值模拟模型结果:与对照组比较,MS+AF+血栓组、MS+AF组和MR+AF组在左、右肺静脉入口处的左心房区域,湍流切应力升高最显著;各组间两两比较,左心房内在湍流切应力变化最明显的区域,即:肺静脉入口处,由大到小的顺序依次是:MS+AF+血栓组、MS+AF组、MR+AF组、MS组、MR组、对照组;左心房壁面压力由大到小的顺序依次是:MS+AF+血栓组、MS+AF组、MR+AF组、MS组、MR组、对照组,其中壁面压力升高最显著的区域位于肺静脉入口处,以及左心耳内,与湍流切应力升高显著部位吻合;左心房内的流场均匀性以MS+AF+血栓组最差,其次是MS+AF组、MR+AF组、MS组、MR组,与湍流切应力和壁面压力吻合,其中速度流场在左心耳开口部位,流速降低最明显,与临床左心房内的血栓好发部位吻合。[结论](1)成功构建左心房流场数值模拟模型,直观的分析左心房内湍流切应力、壁面压力和速度流场的变化;(2)瓣膜性AF左心房流场中所产生的湍流切应力以及紊乱的血流流场是导致心房进行性损伤和血栓形成的重要因素之一。(3)KCa2.3/3.1、AKT1、P300的mRNA和蛋白表达上调是瓣膜性AF心房组织损伤及其血栓形成的重要原因。第三部分不同时间和不同切应力变化对心肌细胞KCa2.3/3.1表达影响的研究[目的]探讨通过不同时间和不同切应力对心肌细胞KCa2.3/3.1表达变化的影响。[方法]将心肌细胞置于培养液中,运用流体剪切力细胞实验系统(TY-FSS110),在不同时间(0.5 h、1 h、2 h)给予心肌细胞不同大小的层流切应力(5dynes/cm2、15dynes/cm2、24dynes/cm2),观察心肌细胞在体外条件下,不同层流切应力不同时间点心肌细胞形态学变化,采用Real-Time PCR技术,检测KCa2.3/3.1以及AKT1、P300在心肌细胞的mRNA表达情况;采用Western Blot技术,检测KCa2.3/3.1以及AKT1、P300在心肌细胞蛋白的表达情况。选取TRAM-34抑制剂浓度(3μM),添加于5dyne/cm2组,作用时间为2h;检测KCa2.3/3.1以及AKT1、P300在心肌细胞的mRNA和蛋白的表达情况。经统计学分析,比较各组与对照组之间的差异。[结果]层流切应力加载干预后,正常组细胞随时间推移除有增殖外,未见其他明显变化,5dyne/cm2、15dyne/cm2组细胞间隙增宽,形态变长,细胞沿流动腔长轴方向伸长,细胞排列接近平行于层流切应力的方向,此变化随着加载时间的延长,变化也逐渐明显,呈一定的时间依赖性,以5dyne/cm2组显著。24dyne/cm2组的细胞形态学未见明显改变,但随着加载时间的增加,该组细胞的增殖变慢。Real-Time PCR和WesternBlot结果显示,与正常组比较,心肌细胞在时间1h和2h加载5dyne/cm2、15dyne/cm2时KCa2.3/3.1的mRNA和蛋白表达水平显著上调(P<0.01),AKT1和P300mRNA和蛋白表达水平上调(P<0.05),且随着加载时间的延长,表达差异逐渐显著,呈一定的时间依赖性,提示心肌细胞在加载5dyne/cm2、15dyne/cm2 层流切应力时激活 KCa2.3/3.1离子通道。而 24dyne/cm2组在0.5h、1h、2h时,KCa2.3/3.1、AKT1和P300的mRNA和蛋白表达与正常组比较,差异无统计学意义(P>0.05),说明心肌细胞在加载24dyne/cm2层流切应力时对KCa2.3/3.1离子通道无明显影响。5dyne/cm2/2h组给予抑制剂后,Real-Time PCR和WesternBlot结果显示,与正常组比较KCa2.3/3.1的mRNA和蛋白表达水平显著下调(P<0.01),AKT1和P300的mRNA和蛋白表达水平同时下调,差异具有统计学意义(P<0.05),表明AKT1和P300可能是KCa2.3/3.1通路的下游基因;同时KCa3.1被抑制后,KCa2.3的表达也有下调,说明KCa2.3和KCa3.1这两个通路之间存在相互作用。[结论](1)KCa2.3/3.1离子通道可以响应层流切应力的力学.信号变化,是将流体力学信号转化为生物学行为的桥梁;(2)低层流切应力可以通过调控心肌细胞KCa2.3/3.1离子通道导致心肌细胞损伤。