目的尖锐湿疣(condylomata acuminate, CA)是最常见的性传播疾病之一,有报道称性活跃人群一生中感染CA的风险率高达80%[1]。该病常以亚临床感染形式存在,它具有传染性强、难治、复发率高等的特点[2],给患者造成了巨大的健康和经济负担。人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)11型是引起CA最常见的HPV亚型之一。HPV早期基因E7及其表达产物在病毒持续感染以及致癌机制中发挥重要作用,是目前研究治疗性疫苗主要的靶位点之一。但是目前尚无商业化HPV11E7蛋白或抗体,且HPV感染的高度嗜上皮性和严格的种属特异性使得HPV体外培养和感染模型很难建立,在很大程度上限制了对其致病机制的研究。因此通过分子生物学方法获得大量HPV11E7蛋白及其多克隆抗体能为进一步研究HPV11E7蛋白的生物学功能和以HPV11E7蛋白为基础的治疗性疫苗奠定良好基础。本研究通过构建原核表达载体pGEX-4T2-HPV11E7,转化入大肠杆菌JM109感受态细胞诱导产生大量可溶性蛋白GST-HPV11E7,纯化蛋白后进一步免疫新西兰兔获得抗HPV11E7多价兔抗血清。经纯化获得抗HPV11E7多克隆抗体IgG,进一步鉴定其效价及特异性,为临床及科研提供了崭新的检测手段。方法一、重组HPV11E7原核及真核表达载体的构建与鉴定设计引物用于构建pGEX-4T2-HPV11E原核表达载体,以HPV全病毒基因组质粒(HPV11purified plasmid DNA)为模板,通过PCR扩增产物连接至pMD(?)18-T Vector,经EcoRⅠ和NotⅠ酶切回收的DNA连接至pGEX-4T2Vector,经EcoR I和NotⅠ双酶切鉴定,测序正确后将原核重组载体pGEX-4T2-HPV11E7转化至E.coliJM109感受态细胞。设计引物用于构建pEGFP-C1-HPV11E7真核表达载体,以HPV全病毒基因组质粒(HPV11purified plasmid DNA)为模板,通过PCR扩增产物连接至pMD(?)18-T Vector,经E’coRⅠ和BamHⅠ酶切回收的DNA连接至pEGFP-C1Vector,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定,测序正确后,准备转染HEK-293细胞。二、GST-HPV11E7蛋白的表达、纯化及鉴定将pGEX-4T2-HPV11E7转化后的E.coli JM109感受态细胞接种于含100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB培养液中37℃培养。待OD600达0.4～0.6时,加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L,26℃诱导培养约6h,离心收集细菌,经超声破碎裂解,离心分离上清和沉淀。经15%SDS-PAGE鉴定细菌裂解产物的上清中含目的蛋白GST-HPV11E7后,取菌液上清与谷胱甘肽亲和层析柱结合、凝血酶切除GST标签,PBS透析过夜回收蛋白。经凝胶电泳鉴定靶蛋白纯度,并定量。三. HPV11E7蛋白兔多克隆抗体的制备、鉴定、纯化及效价分析纯化后的HPV11E7蛋白免疫新西兰兔。经初次免疫,3次加强免疫后采血行双向免疫扩散法测定血清抗体效价。当效价高于1：8,行终免疫后心脏采血获得抗HPV11E7多价兔抗血清。按rProtein G Agarose说明书,进一步纯化血清获得兔抗HPV11E7多克隆抗体IgG. HPV11E7蛋白经15%SDS-PAGE凝胶电泳后转膜,以不同稀释度(1:200、1:400、1:800、1:16000、1:32000、1:64000)r HPV11E7多克隆抗体IgG为一抗,山羊抗兔-HRP为二抗进行免疫印迹实验。牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)作为空白对照。四、抗HPV11E7多克隆抗体IgG的免疫印迹及免疫荧光鉴定瞬时转染pEGFP-C1、pEGFP-C1-HPV11E7到HEK-293T细胞,提取蛋白后经15%SDS-PAGE凝胶电泳后,以1：1000抗HPV11E7多克隆抗体IgG为一抗、山羊抗兔-HRP为二抗孵育后进行免疫印迹实验。未转染的HEK-293T细胞作为对照。未转染的HEK293T细胞、瞬时转染pEGFP-C1和PEGFP-C1-HPV11E7的HEK293T细胞爬片,经甲醛固定、Triton X-100孵育及山羊血清封闭,1：500抗HPV11E7兔多克隆抗体IgG为一抗,荧光抗体Alexa Flour(?)555标记的山羊抗兔为二抗避光孵育,0.5mg/L DAPI避光染色,荧光显微镜镜检。结果一、重组HPV11E7原核及真核表达载体的构建与鉴定HPV11E7基因经PCR扩增后,行1%琼脂糖电泳鉴定,在310bp处可见一清晰目的条带。将扩增片段克隆至pMD-18T载体及亚克隆至pGEX-4T2(真核为pEGFP-C1)载体时,分别用EcoR I和Not Ⅰ(真核为BamH I)进行酶切鉴定,1%琼脂糖电泳结果显示在310bp处各有一小带。对克隆成功的pGEX-4T2-HPV11E7及pEGFP-C1-HPV11E7进行测序,经BLAST比对,完全正确。二、GST-HPV11E7融合蛋白的获得及鉴定原核表达载体pGEX-4T2-HPV11E7转化的大肠杆菌JM109经诱导培养,超声粉碎所得菌液经15%SDS-PAGE电泳分析,在37KD处出现目的蛋白条带,符合预期蛋白GST-HPV11E7大小。凝血酶酶切纯化获得的HPV11E7蛋白经15%SDS-PAGE电泳分析,在11KD处出现目的蛋白条带,符合HPV11E7蛋白预期分子量。三、HPV11E7蛋白兔多克隆抗体的制备、鉴定、纯化及效价分析将HPV11E7蛋白免疫接种兔的血清与HPV11E7蛋白抗原进行双向免疫扩散实验,两孔之间出现沉淀线,得血清效价达1：32。获得的血清进一步纯化所得的抗HPV11E7多克隆兔抗体IgG经免疫印迹鉴定发现,在分子量约11KD处出现一特异性条带,与HPV11E7蛋白大小相符,且无杂带,说明该多克隆抗体IgG能特异的识别HPV11E7蛋白,且IgG抗体效价超过1：64000。四、抗HPV11E7多克隆抗体IgG的免疫印迹及免疫荧光鉴定用所制备的多克隆抗体1：1000稀释检测PEGFP-C1-HPV11E7转染后的HEK-293T细胞,15%SDS-PAGE电泳显示在39KD处出现EGFP-HPV11E7融合蛋白的特征条带。而转染pEGFP-C1或未经转染的HEK293T细胞则未见相应条带。提示稀释效价高时,所制备的抗HPV11E7多克隆抗体的特异性及敏感性仍较好。用免疫荧光法鉴定1：500稀释的抗HPV11E7多克隆抗体IgG在转染细胞中的应用价值,发现未经转染的HEK-293T细胞无绿色或红色荧光。而转染pEGFP-C1及pEGFP-C1-HPV11E7的细胞中可见绿色荧光蛋白EGFP的表达。经重组质粒pEGFP-C1-HPV11E7转染的HEK293T细胞可见特异性红色荧光表达,而转染pEGFP-C1质粒的细胞中未见特异性红色荧光。说明抗HPV11E7兔多克隆抗体IgG可特异性识别HEK-293T细胞核中的E7蛋白。提示稀释效价高时,所制备的抗HPV11E7多克隆抗体的特异性及敏感性仍较好。结论1、成功表达并纯化了大量可溶性HPV11E7蛋白。2、免疫新西兰雌兔获得抗HPV11E7蛋白多克隆抗血清,成功获得并纯化为高效价的兔抗HPV11E7多克隆抗体IgG。3、经免疫印迹及免疫荧光法鉴定,HPV11E7多克隆抗体IgG能特异性识别HPV11E7蛋白,并可特异性识别重组质粒PEGFP-C1-HPV11E7转染的HEK-293细胞中表达的HPV11E7蛋白,提示该抗体特异性及敏感性较高。4、所获得的HPV11E7蛋白可为进一步研究该蛋白功能、开发治疗性疫苗提供实验基础。而抗HPV11E7多克隆抗体IgG的成功制备,可为临床和科研提供崭新的检测手段。