[研究背景]霍乱(Cholera)是一古老的急性肠道传染病,全球发生的七次霍乱大流行都严重危害着人们的生命和健康,特别是对于发展中国家而言更是重大的公共卫生问题。霍乱的病原体霍乱弧菌(Vibrio cholerae, V. cholerae)是一革兰氏阴性弧菌,可分为200多个血清型,其中O1群和O139群是两种最为重要的能引起严重临床症状且能引起霍乱暴发流行的血清型,O1群主要包括小川型(Ogawa)和稻叶型(Inaba)两种血清型以及古典型(Classical biotype)和El Tor型(El Tor biotype)两种生物型。在全球前六次的霍乱大流行中,病原体主要是O1群古典型霍乱弧菌,而自1961年起第七次霍乱流行中,O1群El Tor型取代了古典型成为优势菌型,并与1964年传入中国广东,同年在山东检出,此后波及全省各地区。1992年,O139群霍乱弧菌作为新的血清型在印度出现并迅速向邻国引起暴发疫情,第二年在中国新疆出现了O13群霍乱病例,进而于1997年在烟台莱阳检出山东省首株O139群霍乱弧菌。自1964年以来,霍乱疫情在山东省一直没有间断,经历了多次暴发流行且累及各个地区,血清型也经过了O1群小川型、O1群稻叶型和O139群多次变化。由于历史原因,1964～1975年期间霍乱疫情报告工作不完善,有关的霍乱疫情报告及记录均为空白。本研究对山东省自1976年至今霍乱疫情流行病学特征及不同时间和地区代表菌株的毒力基因、脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)基因分型等分子流行病学研究能够细致的分析霍乱在局部地区的流行特征时空变异规律,对霍乱疫情的防控有着更加现实的指导意义,同时山东霍乱的流行特征也能反映全国乃至全球的态势,对大范围的研究有着补充作用。[研究目的]1、系统分析山东省霍乱疫情的时间、地区、人群等三间分布流行病学特征；2、细致了解山东省霍乱弧菌血清型、毒力基因及PFGE基因分型的时空分布及变化规律,同时探讨三者之间的关系；3、初步建立山东省霍乱弧菌的PFGE基因分型数据库,便于以后霍乱疫情的溯源及比对分析。[研究方法]1、流行病学资料整理：对山东省自1976年以来登记的所有霍乱疫情菌株血清型、分离时间、分离地点、病人临床资料、流行强度等流行病学资料进行整理。2、菌株选择及复核：根据流行病资料选取时间和空间两个维度的代表菌株,按照以暴发为主、兼顾散发的原则选取代表菌株,同时增菌分离培养及血清凝集和生化鉴定。3、脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型：按照PulseNet霍乱弧菌PFGE分型的标准方案进行操作,细菌裂解时间为1h,Not酶切时间为4h,电泳条件Blockl初始和最终转换时间为2s和10s,电泳时间为13h,Block2中时间分别为20s、25s和6h。4、毒力基因检测：提取代表菌株核酸,PCR检测ctxAB、 tcpA、 tcp1、toxR、 rtxA和hlyA等6种毒力基因。5、数据分析：利用SAS9.1软件对山东省霍乱弧菌血清型毒力基因的分布差异等分类数据进行卡方检验；利用Bionumerics6.0软件对代表菌株的PFGE条带进行聚类分析,结合流行病学资料分析时空变化规律。[结果]1、流行病学特征：(1)自1976年以来,山东省各地区均有霍乱疫情出现,其中鲁西南和鲁北地区最为严重,鲁中地区患者相对较少；(2)自1976年以来,山东省霍乱病例几乎每年均有出现,其中在1983年～1984年和1994年出现了两个流行高峰；(3)从1976年至今山东省霍乱疫情分离菌株依次经历了小川型、稻叶型、和0139群的更替变迁过程；(4)小川型霍乱弧菌疫情主要集中在鲁北地区,而稻叶型霍乱弧菌则主要集中在鲁西南地区；(5)01群霍乱疫情患者年龄分布较为均匀,而0139群霍乱患者多为老年人。2、毒力基因分布：(1)毒力基因hlyA和toxR,rtxA在环境株和临床分离株阳性率均接近100%,而临床分离株rtxAB、 tcp I和tcpA三种毒力基因的阳性率则远高于环境分离株；(2)临床分离株ctxAB、 tcp I和tcpA三种毒力基因的阳性率有随时间上升的趋势,但2000年之后优势菌群0139群霍乱弧菌毒力基因的携带率有所降低；(3)毒力基因tcp I和tcpA表达较为一致,且在暴发疫情分离株的阳性率高于散发疫情菌株,而ctxAB没有明显差异。3、PFGE基因分型：(1)250株代表菌株整体上主要聚为PⅠ、PⅡ、PⅢ和PⅣ4类,前3类和血清血型相吻合,依次为临床分离株O1群稻叶型、0139群和01群小川型,而PⅣ主要为毒力基因缺失的菌株,来源及血清型较为混杂；(2)PⅠ可进一步聚类为PⅠa和PⅠb亚类,其中PⅠa主要为1980年～1983年鲁西南地区菌株,PⅠb主要为2001年鲁中和鲁北地区菌株；PⅡ可分为PⅡa和PⅡb亚类,PⅡa为2009年之前的0139群菌株,PⅡb为2013年济宁霍乱疫情菌株；PⅢ可分为PⅢa、PⅢb和PⅢc亚类,其中PⅢa为1998年～1999年分散全省的菌株形成的亚类,PⅢb为1986年～1997年主要分布于鲁东和鲁北地区菌株形成的亚类,PⅢc主要是1978年济宁和日照分离菌株；PⅣ类的菌株来源较为混乱,但毒力基因缺失为其共同特征；(3)250株霍乱弧菌形成了179个PFGE型,在每个亚类中均存在多菌株形成的同一PFGE型别,这主要见于三种情况：①来自同一霍乱暴发疫情；②不同时间相同地域的霍乱疫情；③同一时间相近地域的霍乱疫情。[结论]1、在第七次全球霍乱大流行中,山东省霍乱疫情持续存在了半个世纪,流行强度发生着变化,不同年份和地区的优势血清型出现多次更替；2、山东省临床分离的霍乱弧菌多为产毒株,且毒力基因ctxAB、 tcp I和tcpA的阳性率存在时间和地区差异。而毒力基因缺失的临床分离株,可能与hlyA、toxR和rtxA等其他较为保守的毒力基因有关；另外,相对于ctxAB, tcp I和tcpA对霍乱疫情的流行强度可能更为重要；3、PFGE基因分型更深入地显示了山东省霍乱弧菌在不同的时间和地区细微变化,与血清型和毒力基因均存在密切的关系,其聚类的基因相似性可为霍乱疫情传统流行病学关联提供线索。