确定有效的药物靶点来寻求新的抗肿瘤免疫治疗是目前医疗界关注的焦点。我们已经确定了一种造血抑制细胞（cell-restricted）丝/苏氨酸蛋白激酶，造血祖激酶1（HPK1），认为其可通过影响PGE2来影响肿瘤的生长，成为治疗性干预的靶标。针对性地破坏HPK1的等位基因可以在T细胞应答反应中为T细胞提供更多的Th1细胞因子产物。HPK1阴性的胸腺细胞比单体对照的野生株细胞扩散的更快，并且对前列腺素E2调解抑制作用有一定的抵抗力。最显著的是，接受HPK1阴性的T细胞转染的老鼠变得能够抵抗肿瘤的生长。此外，树突细胞失去造血祖激酶（HPK1）后具有更强的抗原呈递能力。这使得造HPK1-/-树突细胞在作为癌症疫苗使用时，表现出更强的抗肿瘤免疫反应。若用小分子抑制剂抑制、干扰造血祖激酶1（HPK1）活性能够激活上述两种细胞更强地抗肿瘤活性，导致抗肿瘤潜力的协同放大作用。鉴于HPK1多在造血系统内表达，故HPK1活性抑制剂不会引起其它严重的副作用。主要研究结果如下：首先应用中国仓鼠细胞株（CHO Cell Line）电转染HPK1质粒，分为野生型（WT）和突变型（Mutation），然后用Western blot及免疫组化对比两种基因质粒在CHO细胞中的蛋白表达，发现转染过的CHO细胞，无论是野生型还是突变型，蛋白表达均高于正常未转染CHO细胞，野生型和突变型的蛋白表达量基本等同。随后，再次重复电转HPK1质粒实验，隔夜培养细胞24小时后，通过四环素诱导已转染细胞组和对照未转染质粒细胞组，再Western blot及免疫组化对比两种基因质粒在CHO细胞中的蛋白表达，结果发现诱导过的已转染HPK1的仓鼠细胞系蛋白表达，野生型和突变型蛋白表达明显高于对照组未诱导已转染的细胞株，无论已诱导的电转HPK1的CHO细胞株还是未诱导的电转HPK1的CHO细胞株，其HPK1的蛋白表达基本等同，无明显差异。为建立稳定转染的HPK1CHO细胞株，应用Lipofectamine2000液体转染方法，然后用细胞平板克隆技术配加Zeocin选择性培养液来选择单克隆已转染HPK1的CHO细胞。培养细胞约1个月左右，待细胞稳定成长以后，每种细胞在显微镜镜下选择数个细胞簇较大、健康的HPK1CHO细胞，将其转移至24孔板后继续再选择性培养液中继续培养。待细胞培养足够多后，每个单克隆细胞确定用100万个细胞，通过四环素诱导后再次隔夜培养24小时，用Western Blot查看对比各种单克隆已转染HPK1细胞的蛋白表达情况，从中选取HPK1蛋白表达更高的细胞，从而进行下一步实验。确定HPK1野生型和突变性的蛋白表达后，则须要纯化已提取的HPK1蛋白，我们用Glutathione Sepharose4B GST Beads（谷胱甘肽琼脂糖GST纯化珠）来纯化蛋白，将酒精中存放的谷胱甘肽琼脂糖GST纯化珠用1×PBS清洗干净后，将其与裂解细胞后提取的蛋白进行混合约1-2个小时，将谷胱甘肽琼脂糖GST纯化珠低速离心，收集上清液，尽量不要将谷胱甘肽琼脂糖GST纯化珠吸走，随后用1×PBS再次清洗谷氨酸玻璃珠3次，最后用洗脱液将蛋白从谷胱甘肽琼脂糖GST纯化珠上洗脱下来，洗脱3次，每次15分钟，期间定期将谷胱甘肽琼脂糖GST纯化珠重悬起来，使其与洗脱液充分混匀，最后低速离心，收集上清的洗脱液。Western blot检验已纯化后的HPK1蛋白，分别对比野生型和突变型、纯化后和纯化前的蛋白表达。结果表明，纯化过的蛋白无杂带，分子量位于72Kb的HPK1蛋白表达很高，野生型和突变型蛋白表达无明显差别，纯化蛋白效果理想。前面的实验研究已确定了HPK1的蛋白表达，诱导后蛋白表达极高，为确定随培养细胞的时间延长，蛋白是否稳定表达，融化最初冻存的已转染HPK1的CHO细胞，裂解细胞提取蛋白后，Western Blot对比检验前后两个时间段的蛋白表达情况。结果表明，时隔半年的细胞持续培养，未见HPK1蛋白表达和早先已冻存的转染HPK1的CHO细胞所制造的蛋白表达有衰减，说明我们所转染HPK1的CHO细胞产生的蛋白稳定。并且测定了四环素诱导时间与蛋白表达的结果显示，24小时、48小时、72小时及96小时诱导的效果并无很大的区别。HPK1蛋白表达已确定，且表达稳定，下一步则须要测定以提取纯化的蛋白浓度。用BCA方法检测提取纯化的HPK1蛋白，对比野生型和突变型。结果表明，纯化后的蛋白浓度理想，野生型和突变型的浓度基本等同。经过研究，转染HPK1的CHO细胞可以稳定表达蛋白，但提取的蛋白是否具有活性，野生型和突变型的活性是否有差别，下一步通过放射性32P-γ-ATP来检验提取蛋白的活性表达，结果表明在相同的蛋白浓度、相同的蛋白量、相同的剂量的条件下，蛋白活性完全相反，HPK1野生型的蛋白活性极高，相反的是HPK1突变型的的蛋白活性没有。为确定我们所提取的蛋白及测定的活性准确无误，我们将提取纯化后的蛋白送检到耶鲁大学进行氨基酸测序，结果显示送检蛋白的氨基酸测序结果和HPK1的核苷酸序列，无论是野生型还是突变型均无变化，没有基因突变产生，证明我们所做的实验准确无误。结论：通过本课题的研究，首次通过转染质粒创造了造血祖激酶1在中国仓鼠细胞株（CHO Cell Line）的表达，我们通过Lipofectamine2000脂质体转染及四环素的诱导促使肿瘤细胞株中的靶向基因蛋白高表达，通过检测诱导时间不同的对比以及不同培养时间的对比，以及蛋白浓度的测定对比，确定转染HPK1的中国仓鼠细胞株所表达的蛋白为稳定的高表达蛋白。随后我们肯定了在改变造血祖激酶1的一个特定基因位点，即HPK1等位基因的定向破坏，使其灭活至突变型后，HPK1的蛋白完全失活，通过32P-γ-ATP的检测肯定其突变型不具有任何活性，并且通过提取蛋白的氨基酸序列的测定肯定HPK1野生型及基因突变型的基因在转染肿瘤细胞中通过长时间的培养未发生任何变化。我们揭示了在HPK1等位基因的定向破坏至其失去活性，而蛋白表达未发生改变，则预示着突变后的HPK1失去活性，可能对人的组织、器官不产生副作用，通过转染HPK1质粒至无HPK1质粒的细胞系上来创建稳定的细胞系，在这个实验研究的平台上，我们可以寻求HPK1的抑制剂，从而抑制HPK1的活性，使其不具备杀伤免疫T细胞的作用。并且计划在后续的实验研究中，通过抑制HPK1来改变对PGE2的调节，进而通过促进免疫系统来抑制肿瘤生长，为改善颅内肿瘤的治疗以改善手术所造成的人为损伤而提供新的治疗靶点。