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研究背景:淋巴结是免疫应答的主要场所,在抗感染、抗肿瘤中发挥着重要作用。淋巴结靶向调节对于提高抗感染、抗肿瘤效果至关重要。因此,开发具有淋巴结靶向功能的载药系统已成为现在研究的热点。目的:本研究拟构建具有SR-B1（Scavenger Receptor class Btype1）受体靶向的R4F多肽修饰的红细胞胞外囊泡（R4F-modified Erythrocyte Membrane Vesicles,REMV）,进而实现淋巴结和乳腺癌的高效靶向;通过负载地塞米松（Dexamethasone,Dex）探讨REMV（Dex）改善MRSA（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus）诱导的淋巴结炎的效应及机制;通过负载雷公藤红素（Celastrol,Cel）探讨REMV（Cel）抑制乳腺癌淋巴结转移的效应及机制。方法:1、仿生载体REMV的合成及表征。（1）通过程序性挤压制备纳米级红细胞膜囊泡（Erythrocyte Membrane Vesicles,EMV）,并与不同摩尔的R4F多肽孵育,纳米粒度电位仪检测粒径大小及Zeta电位,高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）鉴定R4F多肽修饰效果,透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM）检测粒径和形状。（2）使用吲哚菁绿（Indocyanine Green,ICG）模拟水溶性药物,近红外染料Di R-BOA模拟脂溶性药物,紫外可见分光光度计及荧光成像检测REMV负载两种不同性质药物能力。（3）培养ldl A7（SR-B1-）和ldl A（m SR-B1）（SR-B1+）细胞,与Di R-BOA终浓度为10μM的EMV（Di R-BOA）和REMV（Di R-BOA）孵育3 h,用共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM）检测细胞Di R-BOA荧光信号强度。（4）准备6~8周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠,分别采用尾根部皮下注射及足垫注射EMV（Di R-BOA）和REMV（Di R-BOA）,1 h、3 h、6 h和12 h后,使用小动物活体成像系统监测Di R-BOA在引流淋巴结中分布,并使用CLSM检测淋巴结中EMV和REMV蓄积和渗透情况。2、REMV（Dex）对MRSA诱导的淋巴结炎的改善作用。（1）REMV纳米载体分别与0.25 mg、0.5 mg、1.0 mg、2.0 mg、4.0 mg Dex孵育,获得REMV（Dex）,通过HPLC检测Dex负载量,计算各组包封率。选取最高包封率的孵育比例,使用透析袋（14 k Da MWCO）连续透析24 h,计算释放率并绘制释放曲线。（2）培养RAW264.7细胞及BMDM细胞,与不同浓度EMV（Di R-BOA）和REMV（Di R-BOA）孵育3 h,用流式细胞术（Flow Cyto Metry,FCM）及CLSM检测细胞内Di R-BOA荧光信号强度。（3）BALB/c雌性小鼠分为Normal、PBS、Dex、EMV（Dex）和REMV（Dex）四组,皮下注射含3×108 CFU的MRSA 100μL,造模2 h给药,造模48 h取淋巴结称重,然后获取单细胞悬液进行细菌涂抹平板,24 h后MRSA菌落计数。（4）FCM检测小鼠淋巴结中CD11b+ly6G+中性粒细胞和CD11b+ly6G-ly6Chi炎症性单核细胞比例及数目变化。（5）ELISA（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）检测血清中的TNF-α和IL-6等细胞因子水平。3、REMV（Cel）对乳腺癌淋巴结转移的抑制作用。（1）REMV纳米载体分别与15.625μg、31.25μg、62.5μg、125μg、250μg、500μg雷公藤红素孵育,获得REMV（Cel）,HPLC检测雷公藤红素负载量,计算各组包封率,选取具有最高包封率的孵育比例,使用透析袋（14 k Da MWCO）连续透析72 h,计算释放率并绘制释放曲线。（2）RAW264.7和4T1细胞与不同浓度的REMV（Cel）孵育24 h后,使用MTS试剂盒检测药物对RAW264.7和4T1的细胞毒性。（3）培养4T1细胞,与不同浓度的EMV（Di R-BOA）和REMV（Di R-BOA）孵育3 h,FCM及CLSM检测细胞内Di R-BOA荧光信号强度。（4）通过足垫注射4T1-m Cheery细胞,建立4T1-m Cheery淋巴结转移模型,造模成功后在小鼠肿瘤周围部位注射50μL EMV（Di R-BOA）和REMV（Di R-BOA）,6 h后取淋巴结并使用CLSM检测REMV（Di R-BOA）在体靶向4T1效果。（5）皮下注射50μL的PBS、Cel、EMV（Cel）和REMV（Cel）,于3 h取淋巴结并获取单细胞悬液,FCM检测淋巴结中内CD4+Fox P3+调节性T细胞比例。（6）通过乳腺垫注射4T1-m Cheery,建立4T1淋巴结转移及全身转移模型,设置PBS、Cel、EMV（Cel）和REMV（Cel）组,在第30天给药,第55天用小动物活体成像系统检测各组小鼠淋巴结转移及其他脏器转移情况,CLSM检测淋巴结中m Cherry荧光信号。（7）取肝脏和肺,统计各组的转移灶数量,并用FCM检测脾脏中CD8+CD44+CD62L-的效应型记忆性T细胞和CD8+CD44+CD62L+中央型记忆性T细胞比例变化。结果:1、仿生载体REMV的合成及表征。（1）DLS（Dynamic Light Scattering）结果显示,多肽与囊泡磷脂摩尔比为0.4/3（nmol/nmol）时,REMV粒径最小,为55±2.5 nm,带负电荷（-12.3±2 m V）,HPLC结果显示,REMV出现R4F多肽特征性液相峰。TEM结果显示,REMV分布均匀,大小一致,呈球形。（2）合成的REMV（ICG）和REMV（Di R-BOA）在波长为780 nm和750 nm处有明显吸收峰,荧光成像结果亦显示两种纳米颗粒均具有较强的近红外荧光信号。（3）CLSM结果显示,REMV组ldl A（m SR-B1）细胞中有很强的Di R-BOA荧光信号,而EMV组无明显荧光信号。SR-B1阴性的ldl A7细胞中,EMV和REMV组都无明显Di R-BOA荧光信号。（4）活体成像结果显示,尾根部皮下注射3 h后,REMV逐渐在腹股沟淋巴结蓄积,并且Di R-BOA的荧光强度显著强于EMV组。足垫注射1 h后,REMV逐渐在在腿弯淋巴结蓄积,3 h逐渐引流至椎骨淋巴结,且Di R-BOA的荧光强度显著强于EMV组。CLSM结果显示,REMV在淋巴结周围和深部蓄积,而EMV则主要分布在淋巴结周围。2、REMV（Dex）对MRSA诱导的淋巴结炎的改善作用。（1）HPLC结果显示,Dex浓度在0.01203~0.1203 mg/m L范围内与出峰面积呈现良好的线性关系（R~2=0.997）,REMV纳米载体与2.0 mg Dex孵育时,具有最高包封率32.1%。释放结果显示,前4 h时REMV（Dex）只释放了47.8%的Dex,24 h时释放了91.7%,具有一定的缓释作用。（2）CLSM结果显示,REMV组RAW264.7细胞及BMDM细胞具有很强的Di R-BOA荧光信号,并且明显强于EMV组。FCM定量结果显示,REMV组Di R-BOA的MFI（Mean Fluorescence Intensity）显著高于EMV组。（3）与PBS组相比,Dex、EMV（Dex）和REMV（Dex）组淋巴结重量减轻,CFU（Colony Forming Units）减少,并且与EMV（Dex）组相比,REMV（Dex）组淋巴结重量更轻,CFU更少。（4）FCM结果显示,与PBS组相比,Dex、EMV（Dex）和REMV（Dex）组淋巴结内中性粒细胞及炎症性单核细胞数目减少,并且与EMV（Dex）组相比,REMV（Dex）组淋巴结内中性粒细胞及炎症性单核细胞数目更少。（5）ELISA结果显示,与PBS组相比,Dex、EMV（Dex）和REMV（Dex）能够降低血清中TNF-α水平;并且与EMV（Dex）组相比,REMV（Dex）组血清中TNF-α及IL-6水平更低。3、REMV（Cel）对乳腺癌淋巴结转移的抑制作用。（1）HPLC结果显示,Cel浓度在1.245~11.205μg/m L范围内与出峰面积呈现良好的线性关系（R2=0.9983）,REMV纳米载体与250μg雷公藤红素孵育时,具有最高包封率23.8%。释放结果显示,前12 h时REMV（Cel）只释放了44.7%的Cel,72 h时释放了81%,具有缓释作用。（2）MTS结果显示,REMV（Cel）对4T1细胞的IC50为350.0 ng/m L,显著小于RAW264.7细胞（IC50=944.2 ng/m L）。（3）CLSM结果显示,REMV组4T1细胞具有很强的Di R-BOA荧光信号,并且明显强于EMV组。FCM定量结果显示,REMV组Di R-BOA的MFI显著高于EMV组。（4）在体靶向结果显示,造模33天后小鼠淋巴结有明显4T1-m Cheery荧光信号,与EMV比较,RMEV组淋巴结边缘和中心部位可以观察到大量的Di R-BOA荧光信号与4T1细胞共定位。（5）FCM结果显示,与Cel组及EMV（Cel）组相比,REMV（Cel）组淋巴结中CD4+Fox P3+的调节性T细胞比例显著下降。（6）与其它对照组相比,离体脏器荧光成像结果显示REMV（Cel）组各脏器几乎无m Cherry荧光信号,并且CLSM结果显示淋巴结中也无明显的m Cherry荧光信号。（7）肝脏及肺转移数目的定量数据显示,REMV（Cel）组肝脏和肺转移病灶数要少于其他对照组。FCM结果显示,REMV（Cel）组CD8+CD44+CD62L-效应型记忆性T细胞和CD8+CD44+CD62L+中央型记忆性T细胞比例显著提高。结论:1、仿生性纳米载体REMV具有小粒径特性及SR-B1受体靶向功能,能够实现淋巴结高效靶向及深部组织渗透。2、REMV（Dex）能够通过靶向调控淋巴结微环境改善MRSA诱导的淋巴结炎。3、REMV（Cel）能够靶向杀伤4T1细胞抑制乳腺癌淋巴结转移,并通过诱导免疫记忆效应抑制乳腺癌多脏器转移。