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研究背景:三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）的特征是不表达或低表达雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2,故不适用激素和抗HER-2靶向治疗方法。此外,TNBC恶性程度高、预后差,其发生复发、转移风险显著高于其他乳腺癌亚型,而癌细胞转移是造成临床死亡的主要原因。目前临床应用的免疫疗法可以延长实体瘤的生存期,但也会存在自身免疫样毒性、耐药性等临床应用障碍。目前,迫切需要开发新的治疗策略来抑制TNBC肿瘤的恶性增殖和转移。以腺相关病毒载体（adeno-associated virus,AAV）为主的基因治疗方法可以规避药物治疗的上述局限性,具有良好的应用前景。EC1-AAV2M载体为本课题组前期构建的一种可在小鼠体内靶向4T-1肿瘤细胞的新型AAV。可溶性PD 1（soluble programmed death-1,sPD1）为 PD1 的胞外结构域,可与膜表面的 PD-L1（programmed cell death ligand 1,PD-L1）相互结合,从而解除T细胞抑制,激发抗肿瘤免疫反应。目的:通过构建sPD1表达质粒并包装具有肿瘤靶向性的重组腺相关病毒EC1-AAV2M-sPD1,尾静脉将其注射至4T-1三阴性乳腺癌荷瘤小鼠体内,病毒能够靶向递送sPD1,阻断肿瘤微环境中的PD1/PD-L1轴,由此解除其对T细胞的抑制作用,最终达到缓解小鼠体内肿瘤生长和肿瘤转移的目的。方法:（1）通过酶切连接将小鼠PD1的胞外段序列插入到AAV表达载体中（含Luciferase序列）,构建pAAV-sPD1表达质粒。然后通过Western Blot和体外生物发光对转染pAAV-sPD1的293T细胞进行检测。（2）通过细胞免疫荧光评估sPD1与4T-1细胞表面PD-L1的结合情况。（3）通过QPCR、细胞感染和生物发光评估EC1-AAV2M-sPD1病毒的活性及体外靶向能力。（4）为了检测EC1-AAV2M-sPD1病毒在体内对4T-1细胞的靶向性及作用时间,通过小动物活体成像分析B16和4T-1双移植瘤BALB/c小鼠体内的荧光表达情况。（5）为了分析EC1-AAV2M-sPD1病毒对肿瘤增殖的影响,对BALB/c雌性荷瘤4T1-Luc小鼠尾静脉注射EC1-AAV2M-sPD1病毒,以EC1-AAV2M-GFP病毒和PBS溶液作为对照。测量荷瘤小鼠的肿瘤体积和体重,IHC染色分析肿瘤中Ki67的表达。（6）通过Western Blot分析肿瘤中E-cadherin的表达,通过H＆E染色分析肺组织中肿瘤转移情况及心、肝、肾、脾组织中的病理变化。结果:（1）成功构建可表达sPD1的pAAV-sPD1质粒。（2）成功包装具有感染能力的EC1-AAV2M-sPD1病毒。（3）实验证明,EC1-AAV2M-sPD1病毒能选择性靶向4T-1三阴性乳腺癌细胞而不靶向B16黑色素瘤细胞。（4）与对照组相比,给予EC1-AAV2M-sPD1病毒基因治疗能有效缓解荷瘤BALB/c小鼠体内4T-1细胞移植瘤的增殖和肺转移。（5）基因治疗对小鼠的的组织器官无明显毒副作用。结论:本研究成功包装出EC1-AAV2M-sPD1病毒,该病毒能在体内、外靶向4T-1肿瘤细胞,并且接受单次病毒治疗后的荷瘤小鼠体内能长时间检测到病毒信号。最重要的是,这种基因治疗策略可显著减少移植瘤小鼠体内中4T-1三阴性乳腺癌细胞的生长和肺转移。总的来说,携带免疫阻断检查点的腺相关病毒载体能成功达到抑制肿瘤生长和转移的目的,这种策略可有望克服因反复给药所造成的耐受性。因此,接受EC1-AAV2M-sPD1病毒治疗是一种潜在的TNBC治疗新策略。本研究建立了一种新型递送免疫抑制分子的基因治疗策略,为进一步TNBC的治疗提供了一种新方法,具有潜在的临床应用前景。