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胰腺癌（pancreatic cancer）是消化道常见的恶性肿瘤之一，其发病逐年增加，已被称为21世纪恶性肿瘤之王。胰腺癌主要是指胰腺外分泌胰腺癌，各种病理分型中最常见的是导管腺癌。胰腺癌的预后极差，5年生存率低于5%，在美国胰腺癌死亡率在所有癌症死亡率中排在第4位[1]。胰腺癌的人群发病率为6/10万至10/10万[2]，近年来呈现上升的趋势，并且有年轻化的倾向。绝大多数胰腺癌患者在诊断明确时已属晚期，只有10-20%的患者在诊断明确时尚具有进行手术切除的机会。因此胰腺癌的早期诊断尤为重要。但目前临床上缺乏有效的进行早期胰腺癌的筛查方法，而慢性胰腺炎、胆管炎等与胰腺癌的临床特征较相似，其与胰腺癌的的鉴别诊断也是临床的一大难题。因此，提高胰腺癌的早期诊断率，是使得更多患者能获得手术切除机会的重要途径。K-ras基因突变在胰腺癌患者的胰腺组织、胰液、粪便及血液均有发现，其中胰腺癌组织中最为常见，其突变频率为75％～95％。K-ras基因突变的常见位点为第12、13、61密码子，其中以发生在第12密码子的突变最为常见。目前针对K-ras基因突变的检测方法较多，主要包括：PCR—DSM(Directsequencing method, DNA直接测序法)， PCR-RFLP(restriction fragment lengthpolymorphism，结合限制性片段长度多态性分析法)， PCR-SSCP(single strandconformation Polymorphism，单链构象多态性)， ARMS(amplification refractorymutation system，扩增受阻突变体系)及PCR-MASA (mutant allele-specificamplification，突变特异性等位基因扩增法）等，以及近年来出现的能进行粗略定量检测K-ras基因突变的High resolution melting analysis（HRMA）、Enriched-PCR&Enzyme Linked Mini-sequence Assay（ELMA），LigAmp assay等方法，然而，这些方法普遍存在检测时间过长或操作较繁琐等缺点。并且，敏感性和特异性不够的问题，也限制了它们的广泛应用。本实验室前期已建立了一种双荧光标记探针联合肽核酸的实时定量PCR检测K-ras基因12密码子突变的方法，其检测探针为针对第12密码子第一位碱基突变三种类型的简并探针K-ras-FAM Tagman MGB探针和针对第12密码子第二位碱基突变三种类型的简并探针K-ras-VIC Tagman MGB探针。结果证实此检测方法能有效地检测K-ras基因第12密码子的六种突变类型，并具有较高的灵敏度（1/107-1/105）。通过对几种胰腺癌细胞株的检测，证实此检测结果和测序结果完全吻合。本研究的目的在于，在本实验室前期建立的双荧光标记探针联合肽核酸的实时定量PCR检测K-ras基因第12密码子突变的方法的基础上，通过改良优化，建立一种能同时定量检测K-ras基因第12密码子及13密码子突变的PCR方法，并将其应用于胰腺癌、慢性胰腺炎及正常人群中的外周血标本检测，评价其检测效率以及鉴别诊断胰腺癌的价值。一、单管PCR定量检测K-ras基因第12、13密码子突变方法的建立目的：建立单管PCR定量检测K-ras基因第12及13密码子突变的方法，并检验其灵敏度和特异度。方法：设计分别由FAM、VIC及NED标记的K-ras-FAM Tagman MGB探针、K-ras-VIC Tagman MGB探针及K-ras-NED Tagman MGB探针。其中K-ras-FAMTagman MGB探针为针对K-ras基因第12密码子六种突变类型的简并探针，K-ras-VIC Tagman MGB探针为针对K-ras基因第13密码子六种突变类型的简并探针, K-ras-NED Tagman MGB探针为针对K-ras基因第12、13密码子野生型的探针；设计针对野生型K-ras基因第12、13密码子的PNA。通过制备野生型和K-ras基因第12、13密码子突变型的基因标准品，并进行倍比稀释，进行绝对定量。在本实验室原PCR检测方法的基础上，进行引物、MIX酶的优化以及探针敏感性特异性和鉴别能力的检测。结果：单管PCR定量检测K-ras基因第12及13密码子突变的方法能够分别有效地检测K-ras基因第12密码子的突变类型及第13密码子的突变类型，并且具有较高的检测灵敏度。通过运用此检测方法对胰腺癌细胞株DNA进行检测，检测结果和测序结果完全吻合，由此证实此检测方法具有良好的应用性。结论：单管PCR定量检测K-ras基因第12及13密码子突变方法可有效地检测K-ras基因第12及13密码子突变，并且具有较高的灵敏度和特异性。二、胰腺癌、慢性胰腺炎和正常人群外周血中K-ras基因第12及13密码子突变的定量检测及意义目的：通过对胰腺癌、慢性胰腺炎和正常人群外周血DNA进行检测，比较三者间K-ras基因突变量的差异，并评价此检测方法运用于胰腺癌鉴别诊断的价值。方法：应用已建立的单管PCR定量检测K-ras基因第12及13密码子突变的方法，对第二军医大学附属长海医院、第四军医大学附属西京医院、沈阳军区总医院、复旦大学附属中山医院、上海交通大学附属瑞金医院、中山大学附属第二医院、首都医科大学附属北京友谊医院、黑龙江省医院消化病院、南方医科大学附属南方医院共9个单位的共668例胰腺癌、慢性胰腺炎、正常人群的外周血DNA进行K-ras基因定量检测。结果：胰腺癌、慢性胰腺炎和正常人群外周血DNA中K-ras基因第12密码子的突变量及突变率存在统计学差异（P＜0.05）；K-ras基因第13密码子的突变量及突变率在胰腺癌与正常人群、慢性胰腺炎与正常人群间存在统计学差异，但在胰腺癌与慢性胰腺炎间不存在统计学差异。K-ras基因第12密码子的检测可用于胰腺癌的诊断及胰腺癌与慢性胰腺炎的鉴别诊断，但敏感性不够高；K-ras基因第13密码子的检测对胰腺癌与正常人群、慢性胰腺炎与正常人群的鉴别诊断具有较高的敏感性，但对胰腺癌与慢性胰腺炎的鉴别诊断价值不理想；K-ras基因第12、13密码子联合检测对胰腺癌的诊断及胰腺癌与慢性胰腺炎的鉴别诊断较K-ras基因第12密码子单一检测敏感性更高。此外，K-ras基因第12密码子突变与胰腺癌患者的性别、年龄、远处转移及临床分期等临床病理指标无明显相关性。结论：通过对外周血样本中K-ras基因突变的定量检测可以用于胰腺癌的早期筛查，并且K-ras基因第12、13密码子联合检测较独立12密码子检测灵敏度更高。