所谓基因组安全位点（Genomic Safe Harbors,GSHs）,就是外源基因整合于基因组上的这些位点后,不但能维持稳定表达,而且不会对內源基因的结构和功能产生异常的调节作用。到目前为止,CRISPR/Cas9 knock-in（敲入）技术已成功应用于多种哺乳动物转基因研究。尽管CRISPR/HDR（Homology Directed Repair）解决了外源基因随机整合的问题,但也会存在位置效应和基因拷贝数的变化,导致转基因表达效率低下。哺乳动物基因组内已经发现了Rosa26,β-actin等安全位点,并利用这些位点进行了精确的基因敲入。在转基因家禽领域,对基因组安全位点研究甚少,限制了CRISPR/Cas9技术的应用。相对于以质粒或病毒载体介导的CRISPR/Cas9 knock-in而言,由单链向导RNA（single guide RNA,sg RNA）与Cas9蛋白复合形成的核糖核蛋白复合物（Ribonucleoproteins,RNP）介导的基因敲入效率及安全性更高。本试验的目的是借助CRISPR-RNP技术将增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）敲入鸡成纤维细胞（DF-1）β-actin基因内含子区域,使EGFP在内源性启动子的作用下表达,为验证鸡β-actin作为基因组安全位点的可行性提供基础资料,为转基因鸡研究奠定技术基础。1.His-Cas9融合蛋白的原核表达、纯化及其在鸡β-actin sg RNA活性验证中的应用重组质粒p ET-NLS-Cas9-6×His转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导His-Cas9融合蛋白表达,并对IPTG浓度、诱导温度以及诱导时间进行了优化;确定His-Cas9融合蛋白以可溶性方式表达;利用Ni-NTA argose介质在非变性条件下纯化His-Cas9融合蛋白。针对鸡β-actin内含子区域,利用在线工具（https://zlab.bio/guide-design-resources）设计4条sg RNA,通过RNP切割双链DNA（Double-Standed DNA,ds DNA）验证His-Cas9蛋白切割活性,并筛选适宜的sg RNA。结果表明:（1）最佳诱导表达条件为0.5 m M IPTG,18℃诱导16 h;（2）使用250 m M咪唑洗脱液能得到不含杂蛋白的His-Cas9融合蛋白;（3）纯化的His-Cas9蛋白活性与商业化Cas9蛋白活性相当;（4）经体外转录获得了4条识别鸡β-actin起始密码上游20～200 bp内含子区的sg RNA,且均能特异性引导His-Cas9蛋白切割靶序列;（5）sg RNA₃活性最高（99.7%）,特异性最强。2.CRISPR-RNP介导的鸡DF-1细胞β-actin位点EGFP体外敲入试验通过PCR分别克隆左、右侧同源臂及EGFP片段,借助重叠PCR和TA克隆技术构建重组质粒p MD^TM-18T-LHA-EGFP-RHA,并以此为模板扩增ds DNA donor模板,使用磷酸酶消化法制备单链DNA（Single-Stranded DNA,ss DNA）donor模板;分别采用转染试剂CRISPR-Fectin^TM和电穿孔将CRISPR-RNP元件转染鸡DF-1细胞,并优化转染条件。通过Image J计算平均荧光强度,流式细胞术分析EGFP阳性率,基因分型（genotyping）分析EGFP整合情况,Western Blot验证EGFP表达,最后通过T7E1酶对五个潜在脱靶位点进行脱靶分析。结果表明:（1）成功制备了EGFP报告基因ss DNA donor模板;（2）转染试剂CRISPR-Fectin^TM未得到满意结果;（3）鸡DF-1细胞电穿孔最佳条件为170 V场强下脉冲3 ms,脉冲一次,阳性率为11.8%,平均荧光强度为50.963,随着ss DNA donor添加量增多,阳性细胞率增加;（4）基因分型证明外源基因准确敲入至目标位点;（5）Western Blot检测显示EGFP在鸡DF-1表达;（6）没有发现脱靶现象。总而言之,本试验获得了与商业化Cas9蛋白活性相当的His-Cas9融合蛋白,并通过CRISPR-RNP基因编辑技术将EGFP报告基因准确敲入到鸡DF-1细胞β-actin内含子中,在内源性启动子作用下驱动EGFP报告基因表达。