骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠后肢缺血的实验研究

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目的观察同种异体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对大鼠缺血后肢的影响并初步探讨其可能机制。方法体外实验:经密度梯度离心分离和贴壁培养相结合的方法从大鼠骨髓中提纯单个核细胞,体外扩增和诱导培养,通过形态学、免疫组化、流式细胞仪等对诱导细胞进行鉴定。体内实验:通过手术方法在大鼠右后肢建立无主干和分支动脉供血的严重缺血模型,随机分成2组,治疗组(n=10)取P4代的大鼠BMSCs经5—溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记后直接注射后肢缺血区肌肉进行细胞移植治疗;对照组(n=10)同法仅注射M199治疗。移植术后进行肢体功能评分,术后4周动脉造影后处死动物,免疫组化法检测缺血区新生血管密度,RT-PCR法测定缺血区肌肉匀浆CD34mRNA、VWFmRNA表达情况,ELISA法测定其VEGF、bFGF的水平。结果体外实验:大鼠BMSCs在体外传代扩增后流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44表达阳性,CD34、CD45为阴性,诱导分化后的细胞具有内皮细胞的形态学特征并具特异性W-P小体,可表达CD34,而不表达CD45,能释放NO。体内实验:大鼠BMSCs可在异体鼠缺血后肢肌肉组织内定居、存活,术后3~4周移植组肢体功能评分明显低于对照组(P<0.05~0.01)。术后4周,移植组缺血组织的微血管密度显著高于对照组(P<0.005)且造影示缺血后肢有良好的侧支循环建立;移植组缺血肌肉组织CD34mRNA、VWFmRNA表达也高于对照组(P<0.01);VEGF、bFGF的水平高于对照组(P<0.05~0.01)。结论大鼠BMSCs在体外VEGF和bFGF联合诱导剂作用下可向血管内皮细胞样细胞方向分化。同种异体BMSCs直接缺血后肢局部移植可诱导新生血管形成,BMSCs分泌的VEGF、bFGF等因子可能在BMSCs移植局部促进血管再生的机制中起重要作用。
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