第一部分miR-143调节甲基苯丙胺致血脑屏障损伤中的作用目的:中枢神经系统疾病大多伴有严重的神经炎性反应,早期研究结果表明,神经炎性反应在脑内病理过程中起重要作用。血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)损伤是甲基苯丙胺致神经炎性反应的重要事件,而miRNA参与BBB的功能调节,研究miR-143在正常小鼠及甲基苯丙胺诱导成瘾小鼠的脑组织之间表达差异,明确miR-143在甲基苯丙胺诱导的BBB破坏中的作用,有助于更新现有关于成瘾致BBB损伤发生和治疗的理论,对临床治疗策略和治疗药物靶标的创新重要意义。方法:对高通量miRNA芯片数据进行结果分析,筛选出甲基苯丙胺成瘾患者血清中表达显著升高的miR-143;进一步分析miR-143在BBB完整性中的作用及其与神经炎性反应之间的关系,应用real-time PCR检测miRNA-143(miR-143)和靶蛋白PUMA mRNA表达水平;应用原位杂交免疫荧光检测内皮细胞标志物CD31与miR-143共定位;应用双光子荧光显微成像技术检测血管通透性和BBB完整性;应用Western blot检测紧密连接蛋白(claudin-5、occlduin、ZO-1)、转录因子(p53、NF-κB、STAT3)、信号通路(ERK、p38、JNK、Akt)蛋白表达水平;应用transwell通透性实验检测人脑微血管内皮细胞通透性;应用染色质免疫沉淀技术检测转录因子与其靶标分子的结合;应用慢病毒转染和小鼠脑微注射技术,结合Western blot和免疫荧光染色技术,在离体和整体水平上验证sigma-1R/miR-143/PUMA轴在BBB完整性中的作用。结果:1)甲基苯丙胺上调脑区(海马、皮层、中脑)和脑微血管内皮细胞中miR-143表达;2)整体水平上,沉默miR-143改善甲基苯丙胺诱导的紧密连接蛋白(claudin-5、occlduin、ZO-1)降低,减轻BBB损伤;3)细胞水平上,沉默miR-143改善甲基苯丙胺引起的人脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白(claudin-5、occlduin、ZO-1)降低,改善内皮细胞通透性增加;4)小鼠脑微注射Anti-miR-143慢病毒可改善由甲基苯丙胺引起的紧密连接蛋白(claudin-5、occlduin、ZO-1)降低和BBB损伤;5)PUMA为miR-143靶基因;6)细胞水平上,沉默PUMA降低内皮细胞紧密连接蛋白(claudin-5、occlduin、ZO-1)表达,内皮细胞通透性增加;过表达PUMA增加人脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白(claudin-5、occlduin、ZO-1)表达,降低内皮细胞通透性;7)PUMA正向调控转录因子p53、NF-κB,从而影响下游紧密连接蛋白(claudin-5、occlduin、ZO-1)表达;8)sigma-1R正向调控miR-143参与调控甲基苯丙胺诱导的BBB损伤过程;9)甲基苯丙胺诱导人脑微血管内皮细胞中MAPK与PI3K/Akt信号通路激活,信号分子发生磷酸化;10)甲基苯丙胺诱导人脑微血管内皮细胞核转录因子STAT3活化,ERK,p38,JNK,PI3K特异性抑制剂预处理细胞后均能显著抑制核转录因子STAT3表达;11)核转录因子STAT3调控靶标分子miR-143表达。结论:甲基苯丙胺通过sigma-1受体激活MAPK与PI3K/Akt信号通路引起转录因子STAT3调控miR-143转录,miR-143靶向PUMA引起紧密连接蛋白表达降低,BBB通透性增加最终导致BBB损伤。沉默miR-143能够缓解甲基苯丙胺引起的BBB损伤,为成瘾性药物致BBB损伤的研究和临床治疗提供理论依据和新的靶标。第二部分mi R-143调节脑卒中致血脑屏障损伤中的作用目的:脑卒中是以局灶性神经功能缺失为特征的急性脑血管病。BBB损伤是脑卒中发生发展的重要始动因素之一,而mi R-143参与BBB的功能调节,circ DLGAP4转录本存在与mi R-143结合的位点,研究circ DLGAP4靶向mi R-143调节脑卒中BBB损伤分子作用机制,明确circ DLGAP4/mi R-143在脑卒中BBB破坏中的作用。有助于更新现有关于脑卒中致BBB损伤发生和治疗的理论,为治疗脑卒中BBB损伤提供新的视角和治疗策略。方法:应用Real-time PCR检测mi R-143和circ DLGAP4表达水平;应用TTC方法和MRI方法检测t MCAO脑卒中模型小鼠梗死体积;应用尾静脉注射Evans Blue方法检测t MCAO脑卒中模型小鼠BBB通透性;应用Western blot技术检测紧密连接蛋白(claudin-5、occlduin、ZO-1)、间充质转化标志物(collagen I、collagen III、α-SMA)、HECTD1蛋白表达水平;应用荧光素酶报告基因(Luciferase)验证circ DLGAP4与mi R-143相互结合作用;应用RNA pull down和原位杂交共定位实验验证circ DLGAP4与mi R-143存在相互结合;应用慢病毒转染和小鼠脑微注射技术,结合Western blot和免疫荧光染色技术,在离体和整体水平上验证circ DLGAP4/mi R-143/HECTD1轴在脑卒中引起的BBB损伤中的作用。结果:1)缺血性脑卒中引起mi R-143上调、BBB损伤;2)整体水平上,沉默mi R-143缓解由脑卒中引起的BBB损伤、紧密连接蛋白(claudin-5、occlduin、ZO-1)降低和间充质转化标志物(collagen I、collagen III、α-SMA)增加,减小梗死体积;3)circ DLGAP4结合吸附mi R-143,缺血性脑卒中引起circ DLGAP4下调;4)整体水平上,过表达circ DLGAP4缓解由t MCAO脑卒中模型引起的BBB损伤、紧密连接蛋白(claudin-5、occlduin、ZO-1)降低和间充质转化标志物(collagen I、collagen III、α-SMA)增加,减小梗死体积;5)细胞水平上,过表达circ DLGAP4能够抑制由OGD/R造成的紧密连接蛋白降低和间充质转化标志物增加;6)细胞水平上,过表达circ DLGAP4能够缓解mi R-143引起的紧密连接蛋白降低和间充质转化标志物增加;7)细胞水平上,间充质转化抑制剂SIS3能够缓解mi R-143引起的紧密连接蛋白降低和间充质转化标志物增加;8)mi R-143靶向调节HECTD1表达;9)mi R-143通过靶向调控HECTD1调节内皮细胞间充质转化;10)整体t MCAO脑卒中模型和细胞OGD/R引起HECTD1下调;11)过表达HECTD1能够缓解由OGD/R造成的紧密连接蛋白降低和间充质转化标志物增加。结论:在缺血性脑卒中条件下激活脑微血管内皮细胞内circ DLGAP4/mi R-143/HECTD1发生间充质转化导致BBB损伤。增加BBB通透性最终导致BBB损伤。沉默mi R-143和过表达circ DLGAP4能够缓解脑卒中引起的BBB损伤,对治疗脑卒中BBB损伤提供新的视角和治疗策略。