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哺乳动物对光照的适应性调节主要表现为3种类型:参与瞳孔对光反应、睡眠或活动时神经内分泌系统以及昼夜节律的调节。有趣的是,许多病人和动物虽然其视杆和视锥细胞功能完全退化,但他们的光照适应性调节功能并没有受到影响或只是部分受损。然而,实验中发现双侧眼球摘除的动物光反应全部丧失,表明除了视杆和视锥细胞以外,眼部还存在其它类型的光感受器细胞。直到近几年在对昼夜节律光感受性的研究中才逐步认识到,一小部分视网膜神经节细胞(RGCs)也具有内在光敏感性,并且这类光敏感性RGCs都表达一种叫做melanopsin的视蛋白。据此,根据功能的不同,将哺乳动物感光系统分为两类,一类为视觉成像系统,用以感受物体的空间和颜色特征,是机体接受外界信息的主要渠道。视觉成像系统的光感受器细胞为位于视网膜外核层的视杆和视锥细胞,感光物质是由生色团视黄醛和视蛋白构成的视色素。另一类为非视觉成像系统,用以感受光的强度,引起日节律协同化和瞳孔对光反应等,使机体的生理和行为与外界光学环境保持协调性。非视觉成像系统的光感受器细胞为RGCs,感光物质是视色素melanopsin。随着生活质量的提高,外界光环境变化对非视觉成像系统功能异常导致的疾病日益受到重视。为此,本课题通过建立新生小鼠提前开睑模型,从细胞和分子水平研究小鼠出生后视网膜发育过程中melanopsin的表达,以及光刺激对melanopsin表达的影响,为更深一步揭示melanopsin在非视觉成像系统中所起作用奠定基础。主要研究内容包括:第一部分提前开睑光刺激动物模型的建立及melanopsin阳性细胞的形态学研究研究目的建立新生小鼠提前开睑光刺激模型,研究在视网膜发育过程中melanopsin阳性RGCs的形态学特点,及提前光刺激对其表达的影响。材料与方法取新生4d C57BL/6J小鼠,沿右眼上、下睑裂沟轻轻划开,防止眼睑重新粘连闭合,模拟自然昼夜节律变化将模型鼠放置在12h自然光照、12h黑暗环境中循环饲养。左眼作为自身对照。模型鼠鼠龄为5d、6d、7d、14d、90d时分别取材进行眼球灌注固定,免疫荧光染色测定在视网膜发育不同阶段melanopsin阳性RGCs在提前光照组和对照组的表达。结果1.C57BL/6J新生小鼠提前开睑光刺激动物模型的成功建立,可以动态观察正常和提前光刺激条件下视网膜连续发育的各个阶段melanopsin阳性RGCs的表达。2.免疫荧光染色结果显示,melanopsin阳性RGCs分布于一小部分RGCs胞体的细胞膜、树突和轴突,树突和轴突的阳性染色呈串珠状,树突的分支相互吻合,形成完整的网状结构。3.随着视网膜的发育,正常和提前开睑的新生小鼠melanopsin阳性RGCs表达均减少,但提前开睑组减少更明显。结论1.C57BL/6J新生小鼠提前开睑光刺激动物模型的成功建立,为研究在视网膜发育过程中提前光刺激对melanopsin表达的影响提供了可能。2.melanopsin阳性RGCs的结构与功能密切相关,其结构利于视网膜光感受效应的空间整合和扩大melanopsn阳性细胞的辐射范围,同时这种结构便于RGCs感受外界环境光强度的总体水平,符合昼夜节律光协同化的需要。3.提前开睑光刺激使melanopsin阳性RGCs数量减少,提示在视网膜发育过程中,光照可能是影响melanopsin表达的主要原因之一。第二部分提前光刺激对视网膜发育过程中melanopsin在分子水平表达的影响研究目的研究视网膜发育过程中和提前光照条件下melanopsin在转录和翻译水平的表达和变化规律,并探讨其可能机制及意义。材料与方法模型鼠鼠龄为5d、6d、7d、14d、90d时分别提取视网膜RNA和蛋白,运用RT-PCR和Western blotting方法检测在以上时间点melanopsin在转录和翻译水平的表达变化。结果1.RT-PCR检测不同时间点melanopsin mRNA表达水平提前开睑组melanopsin mRNA表达量在P5时最多,之后逐步下降;对照组mRNA表达同样遵循此规律(P＜0.05)。组间比较结果提示,在P90之前,提前开睑组mRNA表达量均少于其自身对照组(P＜0.05);但P90时提前开睑组和对照组melanopsin mRNA含量差异无统计学意义(P＞0.05)。2.Western blotting检测不同时间点melanopsin蛋白表达水平P5至P14期间随着鼠龄的增加,提前开睑组和对照组melanopsin蛋白表达量均呈下降趋势,且相同时间点提前开睑组melanopsin蛋白表达量较自身对照组降低(P＜0.05);P90时melanopsin表达最少,且此时提前开睑组和对照组melanopsin蛋白含量差异无统计学意义(P＞0.05)。结论RT-PCR和.Western blotting结果均提示新生小鼠在P14之前仍处于视网膜光敏感性RGCs发育的关键时期,光刺激可以下调melanopsin的表达,可能是机体对昼夜节律改变的代偿性调节机制之一。