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卵巢癌(Ovarian cancer)是妇科肿瘤中死亡率最高的肿瘤,发病率居妇女所有的恶性肿瘤的第六位。死亡率高的主要原因是卵巢癌耐药以及临床早期难以诊断。卵巢癌细胞易于对化疗药物如顺铂、紫杉醇等产生耐药性,从而导致治疗失败。卵巢癌耐药极大的影响了卵巢癌的预后,因此研究卵巢癌耐药的发生和发展的机制,继而通过逆转卵巢癌耐药,能够大大提高卵巢癌化疗的效果。MicroRNAs (miRNAs)是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,长约20～25个核苷酸。可通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA,并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶1nRNA的翻译。最近的研究表明miRNA参与各种癌症的发生发展。进一步研究表明,卵巢癌耐药的发生发展过程也与miRNA有着密切的关系。因此,本研究以miRNA 130b为研究对象,揭示其在卵巢癌耐药中的作用。第一部分miR-130b在卵巢组织中的表达状况的研究目的研究miR-130b在恶性,良性卵巢肿瘤组织及正常卵巢组织中的表达差异。方法提取47例恶性,7例良性卵巢肿瘤组织及16例正常卵巢组织的RNA。用茎环实时荧光定量法检测niR-130b在组织中的相对表达水平。结果miR-130b在正常卵巢组织,良性,恶性卵巢肿瘤组织中的表达呈下降趋势。在FIGO分期为Ⅲ～Ⅳ期的患者中miR-130b的表达水平显著低于Ⅰ-Ⅱ期的患者(P=0.027)。miR-130b表达水平与年龄及病理类型无明显相关性(P>0.05)。在低表达miR-130b的恶性病例中复发率明显高于高表达的恶性病例(P=0.014)。结论miR-130b在恶性卵巢组织中低表达,与FIGO分期呈负相关,并且与卵巢癌的复发相关。因此推测miR-130b可能与卵巢癌耐药相关。第二部分miR-130b在卵巢癌细胞耐药机制中的作用研究目的研究niR-130b在卵巢癌细胞耐药中的作用,通过上调／下调其表达,检测对细胞耐药性的影响。方法用茎环实时荧光定量法测定miR-130b在卵巢癌耐药细胞株A2780/TAX, A2780/DDP及SKOV3/TAX中的表达。通过向细胞中转染miR-130b模拟物mimics或者抑制物inhibitors,上调／下调miR-130b的表达,继而用MTT法检测对细胞耐药性的影响以及用细胞计数法检测对细胞活性的影响。结果miR-130b在卵巢癌耐药细胞株A2780/TAX, A2780/DDP, SKOV3/TAX中的表达较亲本株A2780, SKOV3中明显降低(P<0.001)。通过转染miR-130b mimics进入卵巢癌耐药细胞中,细胞耐药性明显下降；而转染miR-130b inhibitors进入卵巢癌亲本株中,细胞耐药性明显增强。细胞活性结果与MTT结果一致。结论miR-130b在卵巢癌耐药细胞中低表达,而增强其表达可以部分逆转耐药。第三部分miR-130b受甲基化的调控目的研究miR-130b的表达是否受甲基化的调控,并进一步研究去甲基化对细胞耐药性的影响。方法提取26例卵巢癌组织及5例卵巢良性肿瘤组织的DNA,用定量甲基化特异性PCR法检测其甲基化水平。在细胞水平检测耐药细胞株和亲本株的甲基化水平,并且用去甲基化药物5-aza-CdR处理后,检测对miR-130b甲基化水平,niR-130b的表达水平,以及细胞耐药性的影响。结果miR-130b在卵巢癌组织的中的甲基化水平显著高于良性卵巢肿瘤组织(P=0.028),并且miR-130b在卵巢组织中的表达水平与甲基化水平呈明显负相关(P=0.024)。细胞水平研究发现,miR-130b在耐药细胞株中的甲基化水平明显高于亲本株。用去甲基化药物处理后,niR-130b的甲基化水平显著降低,表达水平显著上升,而且可以部分逆转细胞耐药性。结论miR-130b的表达受甲基化的调控,去甲基化可以部分逆转卵巢癌细胞耐药。第四部分niR-130b靶向作用于CSF-1目的研究miR-130b靶向调控CSF-1。方法用实时荧光定量法检测29例恶性,7例良性卵巢肿瘤组织及10例正常卵巢组织的CSF-1 mRNA表达水平。免疫组化检测组织中CSF-1的表达水平。转染miR-130b mimics或者inhibitors进入卵巢癌耐药细胞后,qRT-PCR和ELISA检测CSF-1的mRNA及蛋白表达水平。荧光素酶报告基因法检测miR-130b与CSF-1 mRNA的3’-UTR的结合位点。结果卵巢恶性肿瘤组织中CSF-1 mRNA水平较良性肿瘤及正常卵巢组织高(P=0.009)。卵巢恶性肿瘤组织中CSF-1表达阳性率明显高于良性卵巢组织(P=0.003)。卵巢组织中CSF-1 mRNA的表达水平与miR-130b的表达水平呈显著负相关(P=0.034)。转染miR-130b mimics进入卵巢癌耐药细胞株A2780/TAX, A2780/CP和SKOV3/TAX后,CSF-1 mRNA和蛋白水平显著降低。而转染了miR-130b inhibitors进入卵巢癌亲本株A2780和SKOV3后,CSF-1蛋白的表达水平显著升高。荧光素酶报告基因表明miR-130b可特异性的与CSF-1 mRNA的3’-UTR结合,抑制CSF-1的表达。结论CSF-1为niR-130b的靶基因。第五部分miR-130b靶向调控CSF-1在卵巢癌耐药中的作用机制实验一研究CSF-1在卵巢癌耐药中的作用目的通过干扰CSF-1的表达,研究CSF-1在卵巢癌耐药中的作用方法ELISA检测CSF-1在卵巢癌耐药细胞中的表达水平。合成干扰CSF-1的shRNA片段,定向克隆插入Supersilencing shRNA质粒表达载体pGPU6/GFP/Neo,获得CSF-1shRNA表达载体。将CSF-1 shRNA质粒瞬时转染卵巢癌耐药细胞株,MTT法检测细胞耐药性。结果CSF-1在卵巢癌耐药细胞株中的表达水平显著高于亲本株。用shRNA干扰CSF-1的表达后,卵巢癌耐药细胞的耐药性明显下降。用shRNA下调CSF-1的表达后,耐药细胞的增殖能力明显下降。结论下调CSF-1的表达可以逆转卵巢癌细胞耐药。实验二niR-130b靶向调控CSF-1在卵巢癌耐药中的作用机制目的研究miR-130b通过靶向调控CSF-1对卵巢癌细胞的耐药性的影响。方法通过向亲本株中同时转染miR-130b inhibitors和CSF-1 shRNA使得miR-130b和CSF-1的表达同时下调,MTT法检测细胞耐药性的变化。细胞计数检测细胞活性。结果转染了miR-130b inhibitors和CSF-1 shRNA的细胞耐药性明显高于只转染了miR-130b inhibitors的细胞。细胞活性实验的结果与MTT结果一致。结论miR-130b通过靶向作用CSF-1参与卵巢癌耐药。