γ-谷氨酰转肽酶(GGT)是广泛分布于动植物及微生物体内的特异酶,能专一性催化y-谷氨酰基化合物中的γ-谷氨酰键断裂,释放出谷氨酸,表现为水解作用;同时也能将y-谷氨酰基转移到氨基酸及小肽上,生成新的γ-谷氨酰化合物,表现为转肽作用。基于其双重催化特性,γ-谷氨酰转肽酶具有非常广阔的工业应用前景。目前,国内外对GGT的研究主要集中在各种γ-谷氨酰化合物的合成。然而,对于利用该酶制备谷氨酸却鲜有研究。目的本研究以谷氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌的模式菌-C.glutamicum ATCC 13032的GGT(CgGT)为研究对象,对该酶的重组表达、酶学性质、结构基础及其在C.glutam icum发酵谷氨酸中的应用进行了系统的研究,旨在为今后进一步利用其工业化发酵谷氨酸奠定基础,同时也为其更深一步的分子学研究提供必要的参考。方法1.γ-谷氨酰转肽酶基因的克隆、表达及筛选:采用基因工程技术,对目的基因进行重组表达,通过SDS-PAGE及酶活的测定检测γ-谷氨酰转肽酶在不同启动子下的表达情况。2.重组谷氨酸棒状杆菌产酶的发酵优化:通过测定不同时间段的酶活及菌体密度,单因素及正交实验确定重组菌的最佳发酵条件。3.GGT酶的提取及性质研究:采用超声及高压均质机破壁,并使用镍柱对GGT进行分离纯化,通过γ-谷氨酰转肽酶活性的测定方法检测其酶学性质。4.CgGT酶学特性的内在机制:通过生物信息学手段及定点突变技术进行分析。5.CgGT在谷氨酸发酵中的应用:采用SBA-40E测定不同时间段的菌体发酵谷氨酸的含量。结果1.γ-谷氨酰转肽酶基因的克隆、表达及筛选:以C.glutamicum ATCC 13032的基因组为模板,通过PCR技术,成功将其γ-谷氨酰转肽酶的基因(ggt)克隆至Ptac、PmaIEI及PH36三种不同启动子下,形成重组质粒pEKEx2-TC、pEKEx2-MC及pEKEx2-HC,将这三种穿梭质粒转化宿主谷氨酸棒状杆菌原始菌株进行诱导表达,成功筛选出GGT活性是对照组31倍的重组谷氨酸棒状杆菌PTC。2.重组谷氨酸棒状杆菌产酶的发酵优化:通过对筛选出的重组菌PTC的培养工艺进一步的优化,确定了其最佳培养条件为:30℃培养至菌体OD达1.2左右时,向发酵体系中添加终浓度为0.6 mmo l/L的IPTG,诱导培养至27 h;最优培养基为:在本课题组已有的培养基配方基础上,加入Tween-80 0.05%、正十六烷5.0%、山梨醇0.01%,且其最终发酵菌液GGT活力能达到869 U/L,比优化前其活性提高了将近22%。3.GGT酶的提取及性质研究:研究发现该γ-谷氨酰转肽酶属于重组菌PTC的周质酶。使用亲和层析对C端融有His标签的重组CgGT酶进行分离纯化,其分离效果明显,最终纯化后的蛋白酶表现的水解酶比活为5.84 U/mg,为其转肽酶活力的16.67倍。通过SDS-凝胶电泳分析,可知CgGT酶原的分子量为70 kDa,其成熟酶所含大小亚基分子量分别为48及22 kDa。CgGT水解酶的最适pH为7.0,最适反应温度为50℃,该酶在较宽的pH范围内稳定性较好,且重组酶CgGT具有相对较强的的耐热性,在45℃下处理24 h后其活力基本无损失。金属离子Mg2+、Ca2+、Mm2+、K+及Na+在浓度超过5 mol/L的情况下,对酶的活力均有明显的促进作用,尤其是在加入Mg2+和Mn2+的浓度分别为100 mmol/L和50 mmol/L时,CgGT的水解活性分别高达230和202%。4.CgGT酶学特性的内在机制:通过对GGT酶的进化关系、序列比对、同源模型及定点突变的结果进行分析,可知,CgGT酶表现出的酶学性质特点主要是由其独特的底物结合区结构决定的。5.CgGT在谷氨酸发酵中的应用:对强水解酶活性的CgGT提高自身C.glutamicum发酵谷氨酸产量的可行性进行初步的探讨,发现具有高GGT活性的重组菌PTC其在发酵过程中谷氨酸产生量明显高出阴性对照组PP,且在发酵至40 h时,其谷氨酸的产量相比对照组提高了 20%以上。此外,向发酵体系中加入一些酶底物γ-谷氨酰化合物(如Gln、GSH)后,重组菌PTC产酸量能得到进一步的提升,为对照组PP的5.29倍。结论本研究筛选出能高效表达C.glutamicum ATCC 13032 GGT的重组谷氨酸棒状杆菌PTC,其GGT是一个耐温的水解酶,能显著提高C.glutamicum谷氨酸发酵产量。此外,该酶的耐热性及pH不敏感性,对其工业化应用具有较明显的优势,因此该研究对于今后工业化生产谷氨酸具有巨大的商业指导价值。