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背景和目的：近年来随着新型免疫抑制剂的问世以及对移植免疫反应的进一步认识，急性排斥反应发生率明显下降，但移植物半寿期和移植长期存活率提高并不明显。慢性移植物功能损耗已经成为阻碍移植器官长期存活的主要原因。因此如何调控机体内在的免疫调节机制以重新建立长期免疫稳态是减轻慢性移植物功能损害的关键，也是目前移植领域期待解决的关键问题之一。淋巴结是构成免疫系统的不可或缺的组成部分，与脾脏、粘膜免疫相关组织共同构成外周免疫器官。淋巴结中富含各种免疫细胞，共同参与了对淋巴液的滤过和净化以及产生包括体液免疫和细胞免疫等免疫应答反应。肠系膜淋巴结(MLN)是位于肠道系膜区的淋巴结，是局部肠相关淋巴组织(GALT)的重要组成部分，除去上述淋巴结共同的作用之外，肠系膜淋巴结还参与了诱导口服免疫耐受、协助肠道上皮内淋巴细胞下调肠道免疫应答等作用。口服耐受是指经口服途径给予机体异体蛋白抗原，经过一系列复杂的自身调节进而形成免疫系统对该抗原产生特异性免疫无应答或者低应答的状态。故肠系膜淋巴结在维持肠道对必须接触的异体抗原(食物抗原、共生菌抗原)产生免疫无应答或低应答状态起到了至关重要的作用。人体对于免疫系统的调节一直是多通路多因子的复杂调节网络，而不是只依赖某一条信号通路或者某一种细胞分泌的单一细胞因子的作用，故肠系膜淋巴结必须作为一个结构和功能整体才能发挥出复杂的免疫调节功能。exosome是活细胞晚期核内体以胞吐的形式分泌到胞外形成，最早在研究红细胞时被发现，由于其结构和功能的特点使exosome已经成为一种新型细胞间信号传导方式，且不同细胞来源的exosome因其携带的蛋白组成不同而具有各异的功能，如DC分泌的exosome和B细胞分泌的exosome富含共刺激分子(CD86、CD80)和MHC II分子，是T细胞活化的必需刺激因子；人类鼻咽癌来源的exosome含有latent membraneprotein gene1(LMP1)，具有抑制T细胞活化效应；某些肿瘤细胞分泌的exosome能异常地表达Fas ligand (FasL)，介导活化的细胞死亡(activated induced cell death，AICD)。现已证实T细胞，B细胞，树突状细胞，肥大细胞，上皮细胞以及多种肿瘤细胞等均能分泌exosome。那么作为结构和功能整体的肠系膜淋巴结是否也存在组织固有exosome，并通过其进行远端调控？为证实这一设想，我们通过提取肠系膜淋巴结组织固有exosome并检验其生物学组成以及对淋巴细胞增殖的影响。材料和方法：本实验旨比较三种exosome提取方法的优劣以找出最适用于肠系膜淋巴结源性exosome的制备方法，通过此方法完成对肠系膜淋巴结固有exosome的提取，并检测此exosome样本的生物学组成及其对淋巴细胞增殖的影响：(1)运用超滤密度梯度离心法、ExoQuick Precipitation提取法、差速离心法对T细胞源性exosome进行提取；(2)通过电镜观测，操作耗时分析，蛋白定量分析比较得出最优提取方法；(3)通过此法对肠系膜淋巴结与外周淋巴结组织固有exosome进行提取；(4)对所得exosome通过电镜观测，蛋白定量，SDS-PAGE电泳检测比较，并通过HPLC-CHIP-MS/MS蛋白质谱技术检测肠系膜淋巴结固有exosome蛋白组成；(5)最后以混合淋巴细胞培为平台观察其体外生物学功能，Western-Blot检测特定细胞因子的表达。结果：1、超滤密度梯度离心、ExoQuick Precipitation提取法、差速离心法均能够正确的提取T细胞源性exosome；所制备的样本呈类圆形囊泡，囊泡外周可见其膜性结构，直径分布于30-100nm之间，可以单个分布，也可聚集成群，即为exosome。2、超滤密度提取离心法能够在经济省时的基础上获得无蛋白丢失的exosome样本；ExoQuick Precipitation提取法提取耗时长、提取成本高；差速离心法提取过程造成了exosome蛋白丢失；3、使用超滤密度梯度离心法成功的制备了肠系膜淋巴和外周淋巴结结组织源性exosome，电镜下可见其为30-100nm均匀圆形小体，形态显著；4、蛋白定量和SDS-PAGE电泳显示肠系膜淋巴结与外周淋巴结源性exosome所含蛋白在数量和相对分子质量上均存在差异；5、对肠系膜淋巴结源性exosome行蛋白质谱分析，证实其蛋白含量丰富，包括：Cap1Adenylyl cyclase-associated protein1、 Ldha L-lactate dehydrogenase A chain、CsifCytokine synthesis inhibitory factor、Hspa8Heat shock cognate70kDa protein8等蛋白；6、体外混合淋巴细胞培养显示对照组、MLN组、PLN组在OD450处光密度值分别为0.270±0.009、0.191±0.002、0.396±0.023，肠系膜淋巴结源性exosome能抑制淋巴细胞的增殖(P<0.05)，外周淋巴结源性exosome具有促进淋巴细胞增殖的作用(P<0.05)；两种淋巴结固有exosome中均有IL-10的表达，且肠系膜淋巴结固有exosome中IL-10的表达强度要高于外周淋巴结固有exosome。结论：1、超滤密度梯度离心法能够在经济省时的基础上获得无蛋白丢失的exosome样本，是一种较为理想的exosome制备方法；2、肠系膜淋巴结与外周淋巴结均存在组织固有exosome，两者在蛋白表达上的差别预示着不同的生物学功能；通过对肠系膜淋巴结固有exosome的质谱分析证实了其丰富的蛋白组成；3、体外功能实验显示肠系膜淋巴结固有exosome存在某种下调免疫应答的作用，而其中的IL-10高表达状态则可能是导致此现象的原因之一。