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研究背景:生殖支原体黏附蛋白(MgPa)是生殖支原体(Mycoplasma genitalium,Mg)最主要的外膜蛋白,对Mg黏附宿主细胞和感染宿主起着至关重要的作用。然而,尚未见对MgPa特异结合多肽,受体肽或受体蛋白的报道。Mg可能通过细胞吞噬和受体介导作用进入宿主细胞,封闭细胞受体从而阻断Mg入侵是防治生殖支原体感染的一个有效途径。因此,本研究旨在验证课题组前期研究中筛选到的MgPa特异结合多肽是否能抑制MgPa和Mg对宿主细胞的黏附,并直接从宿主细胞上分离鉴定与MgPa结合的受体,促进对生殖支原体侵染机制的认识,将对Mg感染相关疾病的防治有重要意义。研究目的:检测课题组前期研究中筛选到的MgPa特异结合多肽能否抑制rMgPa和Mg对宿主细胞的黏附,为阐明MgPa特异结合多肽的功能奠定实验基础;利用改进的病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)鉴定筛选MgPa细胞受体并检测其功能,为有效预防和治疗Mg感染奠定基础。研究方法:(1)表达含MgPa优势表位(1075~1364 aa)的重组MgPa(rMgPa),亲和层析纯化并超滤后用BCA法测定其浓度。(2)经固相法合成课题组前期研究中从噬菌体随机肽库中筛选到的MgPa特异结合多肽(V-H-W-D-F-R-Q-W-W-Q-P-S)(VS)、(D-W-S-S-W-V-Y-R-D-P-Q-T)(DT)和(H-Y-I-D-F-R-W)(HW)。用间接ELISA鉴定rMgPa与合成多肽的结合情况,间接免疫荧光试验检测rMg Pa和Mg黏附SV-HUC-1细胞的情况和rMgPa抗体与合成肽能否抑制rMgPa和Mg对SV-HUC-1细胞的黏附。(3)改进的VOPBA技术鉴定MgPa在SV-HUC-1细胞膜上的受体;LC-MS质谱分析目标条带含有的蛋白成分,推测可能的受体蛋白;利用间接ELISA、Far-western blotting鉴定受体蛋白,间接免疫荧光试验检测受体蛋白在SV-HUC-1细胞上的分布及其特性。研究结果:(1)SDS-PAGE显示:成功获得分子量约37k Da、纯度较高的rMgPa(含6×His标签),用BCA法经核酸蛋白仪测定,其浓度达到2000μg/mL。(2)间接ELISA结果显示:rMgPa能够分别与VS、DT和HW合成多肽特异结合,与对照多肽(S-V-S-V-G-M-K-P-S-P-R-P)(SP)不能特异结合。(3)间接免疫荧光试验结果表明:rMgPa和Mg都黏附SV-HUC-1细胞;rMgPa抗体和三条合成多肽都能部分抑制rMgPa和Mg对SV-HUC-1细胞的黏附。(4)改进的VOPBA技术从SV-HUC-1细胞膜蛋白中筛选出能与rMg Pa相互作用,分子量约为17kDa的结合分子。(5)LC-MS质谱鉴定结果分析表明,rMg Pa潜在的受体最可能是Cyclophilin A和Histone H2B。(6)间接ELISA结果显示:rMg Pa能够与CyPA和H2B蛋白特异性结合。(7)Far-western blotting试验表明:rMgPa能与SV-HUC-1细胞膜蛋白中的CyPA和H2B结合;约17kDa蛋白条带中的成分能与CyPA抗体和H2B抗体结合,说明蛋白条带中含CyPA和H2B;rMgPa能直接与CyPA和H2B蛋白特异性结合。(8)间接免疫荧光试验表明:CyPA和H2B在SV-HUC-1细胞表面有分布;CyPA和H2B能部分阻止rMgPa和Mg对SV-HUC-1细胞的黏附。结论:(1)从噬菌体随机肽库筛选到的三条多肽可能是MgPa潜在的受体肽;(2)Cyclophilin A和Histone H2B可能是MgPa在SV-HUC-1细胞上的受体蛋白。