在皮肤大面积缺损修复过程中，真皮成分是很重要的。真皮替代物的出现不仅克服了自体表皮膜片操作困难、愈合后上皮组织弹性不佳、耐磨性差、易发生破溃和收缩等缺点，还能提高自体表皮膜片的移植成功率。除此之外，真皮替代物还可单独应用于大面积皮肤缺损，促进创面愈合速度，减少瘢痕形成和创面收缩。组织工程的发展为真皮替代物的研究提供了新的思路。人们就组织工程学的两大关键因素，细胞和支架材料展开研究，将体外培养的真皮成纤维细胞种植到各种支架材料上，试图获得与正常组织结构和功能类似的组织工程真皮。虽然目前已取得了一定的进展，而且有产品已应用于临床，但均不能达到预想的效果。另外，国内的皮肤产品的开发相对较晚，目前为止，还缺乏体外实验的衡量标准。针对以上情况，在本研究中，我们就支架材料的开发、利用和种子细胞标准方面进行了初步的研究工作。 首先我们选择高分子聚合物，聚乳酸作为支架材料。聚乳酸(PLA)是以乳酸为单体合成的一类聚合物，以其无毒、无刺激性、良好生物相容性等优点而被广泛地用作组织工程的支架材料。尤其在组织工程皮肤研究中，与传统的生物支架材料相比，它有来源丰富、易加工成型等优点，而具有广泛的应用前景。在本研究中我们选择以自制的泡沫状聚乳酸为支架，构 ＄。fkkq4＋4kMA建了具有一定结构的组织工程真皮，研究结果如下：1．聚乳酸对皮肤成纤维细胞生物学行为的影响 制作膜状聚乳酸材料，接种正常皮肤成纤维细胞，结果显示，在聚乳酸上生长的皮肤成纤维细胞相互紧密接触，在其表面形成明显的细胞层。透射电镜下观察，成纤维细胞正处于旺盛的蛋白合成状态，说明该材料能够支持皮肤成纤维细胞的正常生长和代谢。2．聚乳酸多孔泡沫材料的制作 应用盐溶法制作聚乳酸泡沫状材料，扫描电镜观察孔径为80－100 tim，孔隙分布均匀且相互贯通，是细胞生长的良好载体。该材料的获得为下一步研究打好了基础。3．组织工程真皮的制备 将聚乳酸泡沫材料作为支架，种植皮肤成纤维细胞。结果显示细胞附着在支架材料上，缓慢增殖，与体内皮肤成纤维细胞的状态相类似；透射电镜下观察，成纤维细胞生长状态良好；l型胶原免疫组化染色表明；支架材料上的皮肤成纤维细胞胶原分泌旺盛。说明应用盐溶法制作的泡沫状聚乳酸膜完全可以用于构建组织工程真皮。 其次，进行了皮肤成纤维细胞的永生化工作。成纤维细胞是组织工程真皮的种子细胞，作为正常体细胞的一种，它的生命期是有限的。为了得到永生化的，性状稳定的人皮肤成纤维细胞，我们选取两种体细胞永生化过程中最常用的成分，LT（SV40大 T抗原）和 hTERT（人端粒酶催化亚单位）进行单独及联合转染，最终得到了与正常成纤维细胞生物学行为接近，性状相对稳定的皮肤成纤维细胞系，至今传代次数已超过48代。研究结果简述如下：1．原代皮肤成纤维细胞的培养 应用酶消化法获取了正常人皮肤成纤维细胞。细胞贴壁后呈典型的纤维细胞样生长。抗Vimentin抗体免疫组织化学染色，结果显示，细胞浆为棕黄色，胞核不着色，呈阳性表达。对照组细胞中无着色，均为阴性，确定该细胞为皮肤成纤维细胞。原代培养的结 4 咏·罕区大磅硕士卑在公之一果是，获得了大量的纯度高的皮肤成纤维细胞，为下一步的研究奠定了基石出。2．分别用 M、叮肌T转染成纤维细胞并进行转染后鉴定 利用脂质体进行LT与hTERT CDN人的转染，G418筛选，获取阳性克隆。分别选取转染后第 3代和第 16代细胞进行免疫组织化学和原位杂交鉴定。结果证明，LT和hTERT已稳定转入细胞中。3．带有荧先蛋白基困和 hTERT CDNA载体的构建 选用带有荧光蛋白基因的空载体，插入经酶切后获得的 hTERT CDNA，转入感受态细菌扩增后，经双酶切鉴定，成功的构建了含有 hTERT CDNA和荧光蛋白报告基困的质粒PIRESZ－EGFP－hTERT。它的应用可以对 hTERT的转染结果进行简单、及时的观察和检测，为基因共转染提供了基础。4 u、叮皿T 共转染咸纤维细胞 取已转染M 的细胞进行PIRESZ－EGFP－hTERT的转染，利用荧光显微镜分离获得阳性克隆，并进行扩大培养以期获得永生化细胞系。5．三种转染细胞生物学行为的比较 对上述实验获得的三种转染细胞进行形态和增殖趋势观察、细胞周期和核型分析以及致瘤性和胶原分泌检测后碍出，LT和hTERT单独转染正常人皮肤成纤维细胞均不能使其永生化，其中 LT还会导致细胞提前进入增殖危机。只有两者进行联合作用才能使其发生永生化的转变；且转化细胞的生物学特性类似正常皮肤成纤维细胞。 以聚乳酸泡沫状材料为支架的组织工程真皮的获得，为真皮替代物进一步的改善和提高打好基础；并为今后以聚乳酸为支架的组织工程皮肤的研制提供良好的开端。而永生化皮肤成纤维细胞的