作为生物学发展史上最伟大的成就之一，核移植技术是发育生物学基础研究的有力工具，在研究配子和胚胎发生、基因表达调控和核质互作等方面作用重要。核移植与人类生殖研究领域密切相关。 治疗性克隆即利用体细胞核移植得到的人囊胚建立病人个体化的人ES细胞系，是体细胞核移植技术与干细胞技术的结合，是治疗一些退行性疾病的新希望，也是当今生命科学最热门的领域之一。 此外，随着妇女年龄的增长，女性卵子质量明显地降低。卵浆质量下降的原因之一可能是抗凋亡因子和促凋亡因子失衡，线粒体膜电势缺陷。人们推测补充健康供卵卵浆可望复原受体卵浆质量。通过细针注射胞浆移植治疗，可在非常低妊娠率的人群中获得大于50％的妊娠率，但其作用机制、有效性和可能存在的危险却仍缺乏深入研究。采用显微操作技术将合子原核从老龄妇女受精卵中分离出来并与已去除原核的年轻妇女受精卵卵浆进行融合的原核移植是最为彻底的核-质置换方式，可避免细针注射胞浆技术存在的各种问题。通过该技术，可利用辅助生育治疗中废弃的胚胎构建成核-质异质重构胚，并结合干细胞技术得到相应的胚胎干细胞。当它们应用于单纯的科学研究，是研究核-质关系的良好模型。 细胞核移植的效率与重构卵的电融合以及激活的效率紧密相关。 提高融合率，是提高核移植效率的主要途径之一。电融合的原理是依据细胞膜的液态性，在短时程的高电脉冲作用下引起膜的流动状态，使2个相互接触的细胞膜融合在一起。电融合效率受到融合液组成(主要是受渗透压)、脉冲性质(强度、数量和持续时间)的影响。 在精子或某些理化因素的刺激下，卵母细胞恢复并完成减数分裂，这一过程称为卵母细胞激活。利用理化因素的卵子激活即卵母细胞的人工激活，卵子人工激活得到的胚胎是人工孤雌生殖的产物。不同激活方法的激活机理基本是一致的，最终目的均是要将停止在MII阶段的卵母细胞恢复分裂周期，这就必须使胞内的MPF和CSF的活性降低或消失。激活途径有两种，一是钙离子信号通路，钙离子载体和电刺激等是通过激发单脉冲性钙离子升高而实现的。二是Mos/MAPK通路，蛋白质合成抑制剂、蛋白磷酸化抑制剂等通过调节蛋白激酶或蛋白磷酸酶活性，降调MPF、CSF而诱导卵母细胞激活。 人类体细胞核移植技术效率的提高对治疗性克隆的发展有巨大的促进作用，然而目前人体细胞核移植的效率非常低，成为治疗性克隆发展的瓶颈，受体卵母细胞未被充分激活可能是症结之一。受到伦理道德的约束，且人源性配子非常珍贵，来源非常有限，都制约了人类核移植技术的发展。另一方面，虽然绵羊、牛、小鼠等哺乳动物体细胞核移植的成功为人的研究提供了可贵的参考，但它们与人的机制与构造毕竟有物种差异，而目前关于人类体细胞核移植的研究尚无确实报道，因此进一步摸索人类体细胞核移植，特别是电融合/电激活的操作细节和实验条件非常重要。 本研究通过摸索不同阶段卵子的电融合/电激活方法，对人合子重构与卵子激活进行了的初步探讨，建立了利用多原核受精卵通过原核移植构建核-质异质胚的方法，优化了人卵母细胞孤雌激活的方案。 第一部分：人原核期合子重构的初步研究 [研究目的]利用人多原核受精卵为材料，摸索人类配子进行电融合/电激活操作的具体技术细节，从电融合条件的优化着眼探索人原核移植技术和构建核-质异构胚胎模型的方法，为研究人类核质间相互关系以及探讨胞浆移植技术的机制提供实验依据和物质基础。 [材料和方法](一)材料在受精后16-19h，在倒置显微镜下观察和记录在本生殖中心行常规体外授精与胚胎移植(IVF-ET)周期病人胚胎的极体(polarbody，PB)排出及原核(pronuclear，PN)形成情况，认为形态为3(或以上)PN+2PB者为多原核受精卵。经病人签署知情同意，共收集多原核受精卵83个纳入本研究。 (二)实验设计分别比较不同电融合液和不同电场条件对原核移植重构合子融合率和发育的影响： 在含钙离子浓度一定的融合液中，在电脉冲次数和脉时一定的条件下，分别用1800v/cm和2000v/cm的电压融合重构合子，比较不同电压对原核移植重构合子融合率和发育的影响。 在电脉冲一定的条件下，分别用不同的融合液(A液：含0.05mM氯化钙；B液：含0.1mM氯化钙)融合重构合子，比较不同钙离子浓度的融合液对重构合子融合率和发育的影响。 (三)实验方法在完成显微操作针和原核期合子的准备后，对目的多原核受精卵进行显微操作，再将构建的核-质异质胚行电融合操作。最后，对重构合子进行序贯的体外培养。 [结果]1.共操作多原核受精卵83个，操作成功60个，操作成功率为72.3％。行电融合60个，融合成功33个，平均融合成功率为55.0％。共卵裂31个，6细胞以上者17，6细胞数占卵裂数54.8％。共有10个重构合子发育至8细胞或以上，其中2个发育为囊胚。 2.比较电融合时不同电压数对原核移植重构合子融合率和发育的影响将电压数由2000v/cm下降到1800v/cm，重构合子融合率(75.0％vs65.0％)、卵裂率(100％vs84.6％)和6-细胞率都没有统计学差异，但6-细胞以上胚胎数则有上升趋势。 3.比较0.05mM和0.1mM钙离子浓度的融合液对原核移植重构合子融合率和发育的影响 钙离子浓度为0.05mM的融合液和0.1mM者比较，融合率(39.3％vs65.0％)、卵裂率(100％vs84.6％)、6-细胞率(63.6％vs72.7％)和囊胚率(18.2％vs0)皆无明显差异，但钙离子浓度升高有促进融合率(65.0％vs.39.3％)的趋势。 第二部分：人卵母细胞孤雌激活方法初探 [研究目的]为建立较为理想的人卵母细胞人工激活方法，比较不同孤雌激活方案和不同来源人卵母细胞的孤雌激活效率，并观察随后的孤雌发育，为进一步探索核移植激活条件、提高人类体细胞核移植效率及进行胚胎孤雌发育的研究奠定基础。 [材料和方法]一、材料经知情同意，本生殖中心行ICSI患者，取卵当天未成熟卵体外培养后成熟期卵子53个(IVM)；另外有24个由健康生育期女性捐赠的体内成熟卵母细胞(IVP)。 二、实验设计分别用电-化序贯激活法和单独化学激活法(离子霉素联合6-DMAP)处理IVM人卵母细胞，探讨两种方法在激活效率和孤雌胚发育潜力上的差异。 以供胚胎干细胞研究的赠卵受精后胚胎为对照，比较IVP卵母细胞孤雌胚胎与受精胚胎发育潜能的差异。 分别用电-化序贯激活法处理人IVP卵母细胞和人IVM卵母细胞，比较不同来源卵母细胞的激活率及其孤雌胚的发育能力。 三、实验方法在卵母细胞进行孤雌激活和体外受精后，对胚胎体外培养和常规观察。 [实验结果]对53个人体外成熟卵母细胞行孤雌激活，共激活31个，对24个人体内成熟卵母细胞行孤雌激活，共激活17个。 进行孤雌激活的人卵母细胞大致遵循常规体外受精(IVF)胚胎发育时程，最早在激活后4-5h可见原核出现，可见1原核1极体(1PN+1PB)，2原核1极体(2PN+1PB)和1原核2极体(1PN+2PB)。 观察IVM卵母细胞来源的孤雌囊胚和IVP卵母细胞来源的孤雌囊胚形态，可见IVM源性囊胚形态较差，囊胚腔较小，胚胎碎片多，内细胞团不清楚、细胞数少；而IVP来源囊胚形态较好，囊胚腔较大，滋养外胚层细胞形态好，内细胞团清晰、细胞数多。 三、单独化学激活法(A)和电-化序贯激活法(B)对人IVM卵母细胞孤雌激活的影响 两种方法处理人IVM卵母细胞对激活率(61.9％vs56.3％)、卵裂率(84.6％vs66.7％)、4-细胞率(100％vs75.0％)皆无明显差异，但用单独化学激活法的孤雌胚发育皆停滞于4-细胞期，而用电-化序贯激活法的孤雌胚可跨越4-细胞期，发育至6-8细胞期，获得一个囊胚。 二、孤雌胚胎与受精胚胎发育潜能的比较 孤雌组与受精组胚胎卵裂率相同，激活率(受精率)和囊胚率无明显差异。但孤雌组D3的优质胚胎率则明显低于受精组。 三、用电-化序贯激活法处理人体内成熟卵母细胞(IVP)和人体外成熟卵母细胞(IVM)孤雌情况的比较 和IVM卵母细胞相比，IVP来源卵母细胞的激活率(70.8％vs56.3％)没有明显差异，但卵裂率明显上升(66.7％vs.100％)。IVM来源孤雌胚75％停滞在4-细胞期，仅得到一个囊胚；而IVP来源孤雌胚6-细胞以上者占70.6％，其中一半发育至囊胚。 [全文结论]1.首次建立了利用废弃多原核受精卵通过原核移植构建人双倍体核-质异质胚的方法，证明了该方法是可行的、经济的。 2.通过改良电融合中电场强度和融合液配方，可改善人类原核移植重构胚的重构效率和发育潜能。 3.孤雌生殖受激活方案和卵子来源影响。电-化序贯激活法较单独化学激活法对IVM卵子孤雌发育更有利。IVP卵母细胞较IVM卵母细胞具有更好的孤雌发育结局，但后者的发育结局可通过优化激活方案从而得到改善。