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结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,也是全球癌症相关性的发病率和死亡率的一个重要原因。手术切除是首选治疗方式。高达50%的患者由于初诊时即存在隐性转移灶最终死于肿瘤的复发。转移是恶性肿瘤的基本特点,其分子机制至今尚未明了。肿瘤发生和发展是多基因改变协同作用的过程,癌基因的激活与抑癌基因的失活是肿瘤发生发展的分子基础。Rho小GTP酶家族属Ras超家族成员,通过激活下游的信号传导通路,参与调节细胞的多种生命过程,如细胞增殖、细胞运动和细胞凋亡等。RhoA是Rho GTP酶家族的重要成员,近年来研究发现在多种恶性肿瘤中高表达,并和肿瘤的发生、侵袭和转移密切相关。然而,RhoA在结直肠癌的发生发展中所起的作用还不是很清楚。国内外尚未见RhoA的shRNA结直肠癌细胞系统的实验研究。因此,我们构建针对RhoA的shRNA并转染至人结肠癌细胞株LoVo,特异性敲除其内源性RhoA的表达,分析结直肠癌侵袭和转移RhoA的作用,为探索结直肠癌基因治疗提供一定的理论基础。实验分如下四部分进行：目的：为研究靶向RhoA基因的shRNA对人结直肠癌细胞株体外生物学行为的影响,根据基因库中的人RhoA基因序列,构建针对RhoA基因的小干扰RNA (siRNA)及其表达载体。方法：设计RhoA靶向的发夹状siRNA, BLAST同源分析证实其特异性,合成2条互补的寡核苷酸链共2对,退火后连接入pGPU6/GFP/Neo载体,转化后进行酶切和序列鉴定。结果：设计出2条针对RhoA的siRNA,将退火后的双链寡核苷酸片段克隆到pGPU6/GFP/Neo载体,经过阳性菌落酶切鉴定与测序,结果正确。结论：成功构建了包含靶向RhoA基因的shRNA的重组表达质粒.目的：研究将RhoA shRNA转染入人结肠癌细胞株LoVo观察其对细胞RhoA表达的沉默效应。方法：设计制备2对针对RhoA基因的shRNA,转染结肠癌细胞株LoVo,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达；采用real-time RT-PCR法测定RhoA mRNA的表达,Western Blot测定RhoA蛋白的表达。结果：与未转染的LoVo比较,LoVo-P1细胞RhoA mRNA与RhoA蛋白的表达强度分别为56.33%±2.18%,33.22%±2.27%, Western blot结果与real-time RT-PCR结果一致,和对照组比较有显著性差异(P<0.05)。结论：构建的RhoA shRNA能有效抑制LoVo细胞中RhoA基因的表达；其中RhoA shRNA1干扰效果最佳。目的：研究RhoAshRNA对结直肠癌细胞株LoVo体外增殖、凋亡、迁移侵袭能力的影响,并初步探讨其可能的机理。方法：以成功构建的稳定表达shRNA的LoVo-P1为研究对象,以未转染的LoVo细胞、LoVo-P0为对照,绘制三组细胞的生长曲线比较生长差异,计算细胞倍增时间；MTT法比较三组细胞存活率的差异；细胞粘附实验、划痕实验、Transwell小室检测三组细胞体外侵袭力的变化。结果：未转染的LoVo细胞、LoVo-P0组细胞的各项指标比较无明显差异。与对照两组的细胞比较,LoVo-P1组的细胞生长明显缓慢,从第四天开始生长速度明显低于另外两组,至对数生长期更明显,生长曲线较平缓；LoVo-P1组的细胞的倍增时间31.24小时左右,延长约10小时。LoVo-P1组的细胞存活率明显下降(P<0.05)。LoVo-P1组的细胞的粘附力明显下降(P<0.05)。LoVo-P1迁移到划痕区的细胞数明显低于对照组(P<0.05)。LoVo-P1穿过Matrigel滤膜的细胞数明显低于对照组(P<0.05)。结论：RhoA干扰质粒P1稳定转染可抑制结肠癌细胞株LoVo的体外生长,使细胞倍增时间延长,抑制癌细胞的体外粘附、迁移侵袭能力。目的：建立裸鼠皮下人结直肠癌种植瘤模型,研究RhoA基因沉默对结肠癌细胞株LoVo裸鼠成瘤的影响。方法：实验细胞分为3组,即稳定转染RhoA shRNA的LoVo-P1组、未转染的LoVo细胞组和转染空载体的LoVo-PO组。将各组结肠癌细胞直接接种于裸鼠皮下,观察种植瘤的生长情况,4周后测量瘤体组织的体积和重量；免疫组化检测肿瘤组织RhoA、VEGF、CD34(观测微血管密度的变化)和MMP-2蛋白表达。结果:：LoVo-P1组的肿瘤生长速度慢于其他两组(P<0.05)。实验结束时瘤体组织的体积与瘤重明显低于其他两组(P<0.05)。免疫组化证实LoVo-P1组的肿瘤组织RhoA. VEGF和MMP-2蛋白表达降低(P<0.05),微血管密度降低(P<0.05)。结论：沉默RhoA可以抑制结肠癌细胞移植瘤的生长。