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基因打靶是80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术.简而言之,它是指外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组,并整合在预定位点,改变细胞遗传特性的方法.我们常见的为胚胎干细胞基因打靶.鉴于基因打靶在转基因过程中的诸多优点,人们不断探索该项技术,并先后在鼠、猪和羊的体细胞中成功应用.该实验构建了两种无启动子打靶载体来敲除牛α1,3-半乳糖基转移酶基因,以期获得α1,3-半乳糖基转移酶基因敲除的牛,并为乳腺生物反应器的研究提供更为理想的实验动物.利用La-PCR的方法,从牛的基因组中成功地得到了约为2.4kb、5.2kb、15.0kb的是三段扩增产物.其中2.4kb片段位于5-7外显子之间,包括了完整的第五及第六内含子;5.2kb片段位于8-9外显子,包括了完整的第八内含子.15.0kb片段位于3-4外显子,包括了完整的第三内含子.测序结果表明所克隆的三个片段均为牛α1,3-半乳糖基转移酶基因的基因组DNA片段.选取其中2.4kb、5.2kb的两个片段分别为左、右同源臂、以pCR-XL-TOPO为骨架载体,构建无启动子打靶载体TOPO-IRESneo7.6;选取15.0kb、2.4kb两片段为左、右同源臂、以pGEM-7zf为骨架载体,构建了另外一种全新的无启动子打靶载体pGEM-7zfneo17.4.从妊娠两月的黄牛胎儿分离成纤维细胞,Sry-PCR法性别鉴定为雄性,经体外培养建立了一个性别已知的牛胎儿成纤维细胞系.以pEGFP-C1质粒为外源DNA,在不同电击参数设置下电击转染牛胎儿成纤维细胞,在倒置荧光显微镜下观察外源基因的转染效率,发现在1kv/cm;3ms;1pulse的电击参数设置下外源基因的转染效率最高.因而在随后的基因敲除实验中使用该套参数设置.纯化的打靶载体TOPO-IRESneo7.6、pGEM-7zfneo17.4分别用Sfi I、Pvu I线性化后,电击转染牛胎儿成纤维细胞,用G418(600μg/ml)筛选,先后共得到44个抗药性细胞克隆,其中仅有1号、2号、3号、4号、5号、6号、7号、8号、9号细胞克隆能够继续扩大培养,其余先后衰老死亡(其中1,2号克隆为成年黑白花奶牛成纤维细胞).扩大培养的细胞克隆分别提取其基因组DNA,经PCR、Southern检测后,初步证明2号、4号、7号克隆的α1,3-半乳糖基转移酶基因的其中一条等位基因与无启动子打靶载体pGEM-7zfneo17.4发生了同源重组.用EcoR I从质粒pLPC-hTERT上切下人端粒酶基因(hTERT),科隆于质粒pIRESneo的EcoR I位点构建了重组载体pIRESneo-hTERT.用Pvu I线性化后电系转染牛胎儿成纤维细胞,和2号、3号细胞克隆,经G418筛选后存活下来的细胞可以看到形态健康,分裂增殖能力明显增强.尤其2号成年黑白花奶牛的成纤维细胞克隆,生长状况明显改善,可以达到对单细胞克隆进行Southern杂交分析的要求.相比之下成年黑白花奶牛的成纤维细胞1号克隆生长几乎处于停滞的状态,说明人端粒酶可以延长牛成纤维细胞的寿命.