防御假单胞菌SN15-2是从番茄根际土壤分离得到的一株具有巨大生防潜力的植物根际促生菌,前期的研究发现其对番茄青枯病等多种植物病害都有较好的防治作用。防御假单胞菌它要通过根际定殖,产生多种抗生素及次级代谢产物,分泌噬铁素以及诱导植物系统抗性等机制拮抗植物病原菌,但是其抵御外界不良环境的能力较弱,因而在制剂加工过程中损耗较大且极易失活。因此研究与菌株生防和抗逆相关的基因及途径对防御假单胞菌的实际应用至关重要。鉴于SN15-2在防治植物病害时具有强大的根际定殖能力,而菌株的运动性与植物根际定殖能力密切相关,因此我们通过构建基因kinB的缺失株ΔkinB,采用运动性平板、生物膜检测、透射电镜观察、拮抗平板实验以及毛细管趋化试验分别检测野生株与突变株的运动(涌动和群集)能力、生物膜形成能力、鞭毛形成、对植物病原菌的拮抗能力以及对植株根茎叶的趋化能力。结果表明防御假单胞菌SN15-2内kinB基因的缺失提高了细菌的运动能力,涌动和群集直径分别增加了 10.3和9.6mm;损害了菌株形成生物膜的能力,对菌株的鞭毛位置和数目以及对病原菌的拮抗能力无显著的影响;提高了菌株对根茎叶的趋化能力,尤其是对根的趋化能力,菌含量可达到2.88×109 CFU/mL,而野生株的菌含量仅为5.47×108 CFU/mL。鉴于SN15-2在制剂加工过程中的抗逆性较差,我们构建了与菌株抗逆性相关的基因betA和betB的缺失株ΔbetA、ΔbetB,首先筛选提高菌株在高渗胁迫下存活率的最适胆碱浓度,接着分别测定SN15-2和突变株ΔbetA、ΔbetB在外源胆碱添加条件下在高渗胁迫下的生长曲线,利用核磁定性和HPLC定量分析检测外源添加胆碱后野生株和突变株胞内累积甜菜碱的情况,qRT-PCR定量检测基因betA和betB在不同处理下的表达情况,最后分别对不同处理下的野生株和突变株进行损伤试验(热击:50℃,4min;冷冻胁迫:-20℃,1h)。结果显示高渗胁迫下SN15-2的菌含量为2.93×1010 CFU/mL,当胆碱浓度为8mM时菌含量可达到1.03×1011 CFU/mL,显著提高了 SN15-2在高渗胁迫下的存活率。在高渗胁迫下添加一定浓度的胆碱可以有效提高SN15-2的生长,对突变株ΔbetA的生长也有一定的提升,但是却远没有野生株提升的多,然而胆碱对ΔbetB在高渗胁迫下的生长没有促进反而有一定的抑制作用。在有前体物质胆碱存在的情况下,高渗胁迫可以刺激SN15-2胞内累积大量的甜菜碱(5.54 g/L),而突变株ΔbetA(3.44 g/L),ΔbetB(2.68 g/L)产生的甜菜碱含量显著低于野生株。仅有胆碱存在不会诱导betA和betB的表达;高渗培养不能诱导betA的表达,但是显著提高了betB的表达;高渗培养与胆碱共同作用可显著诱导基因betA和betB的表达,与对照相比分别提高了 12倍和26倍。高渗胁迫与胆碱共同作用可以显著降低SN15-2在热击和冷冻胁迫下的损伤指数,与对照相比分别降低了 1.01和0.54,而缺失了基因betA和betB的两株突变株的损伤指数均显著高于野生株。本研究成功利用同源重组的原理无缝敲除了防御假单胞菌SN15-2内kinB、betA和betB三个与菌株生防和抗逆性相关的基因,并且通过对野生株与突变株在表型和分子生物学等方面的差异分析,揭示了kinB基因可调控防御假单胞菌SN15-2的运动、生物膜形成及趋化能力;betA和betB是防御假单胞菌SN15-2中胆碱-甜菜碱途径中的关键基因,并且betB基因比betA基因调控甜菜碱形成的能力更强;发现了高渗胁迫与胆碱共同作用可显著提高SN15-2的抗逆性。为SN15-2的生防和抗逆性机理进一步研究奠定了理论基础,也为SN15-2的实际应用提供了技术和方法。