研究背景和目的结直肠癌是一种常见的、严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤。近十年来，结直肠癌在我国的发病率有逐年上升的趋势。转移是影响结直肠癌患者治疗效果和死亡的主要原因。因此探讨与结直肠癌转移相关的因素，阐明结直肠癌转移机制，控制转移，寻找预防和治疗的有效途径，是当前研究的重要方向。研究证明，促肝细胞再生磷酸酶-3(Phosphatase of regenerating liver-3，PRL-3)在结直肠癌发生发展中起重要作用。应用基因表达系列分析(SAGE)技术分析结直肠癌肝转移基因表达谱时发现，PRL-3与结直肠癌肝转移高度相关。最近的研究也发现PRL-3能促进细胞增殖、迁移，并具有增强细胞侵袭、粘附的能力，除此之外在肿瘤血管形成中也起重要作用。PRL-3属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族(protein tyrosine phosphatase，PTP)成员。该家族只有三个成员PRL-1、PRL-2及PRL-3，三个成员氨基酸序列具有超过75％的同源性，在功能上具有相似性。PRLs的催化域都缺少大多数磷酸酶发挥催化作用所需的丝氨酸-苏氨酸残基，只拥有单一的催化结构域。除了在C—末端含有一CAAX序列，可进行异戊烯化外，无其他任何辅助剪接、调节的结构域。PRLs以异戊烯化依赖方式存在于浆膜和内体(endosome)结构，这一生化特征提示它们在细胞信号转导中可能发挥重要作用。尽管目前PRL-3与肿瘤转移的关系已经明确，但是PRL-3在肿瘤转移中的生物学特性尚不十分清楚。因此本研究以寻找PRL-3相互作用蛋白为研究切入点，在通过大量验证实验明确证实PRL-3相互作用蛋白后，重点探讨PRL-3相互作用蛋白对结直肠癌增殖、侵袭及转移的影响和作用机制，阐明PRL-3相互作用蛋白在结直肠癌转移中的主要生物学功能，为结直肠癌转移的早期诊断和治疗提供理论依据。方法1、结直肠癌组织中PRL-3的表达及临床意义应用免疫组化和荧光定量PCR技术从蛋白和mRNA水平检测PRL-3在结直肠正常粘膜、结直肠癌及淋巴结转移癌中的表达，探讨PRL-3与结直肠癌发生发展、侵袭转移的关系。2、PRL-3相互作用蛋白的预测和筛选(1)PRL-3相互作用蛋白的生物信息学预测利用在线分析软件和数据库对PRL-3可能的相互作用蛋白进行生物信息学预测，并对PRL-3及其可能的相互作用蛋白的表达特征进行数字northern杂交分析。(2)酵母双杂交筛选PRL-3相互作用蛋白克隆人PRL-3基因cDNA序列，构建pGBKT7-PRL-3酵母表达载体，以PRL-3蛋白为“诱饵蛋白”，筛选人胎脑cDNA文库，寻找PRL-3相互作用蛋白。3、PRL-3相互作用蛋白的鉴定及其功能的生物信息学分析运用基于蛋白质水平的谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白沉淀、免疫共沉淀和共定位分析等技术对酵母双杂交系统初步筛选的结果进行体内和体外的验证。(1)谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白沉淀(GST-pull down)克隆CDH22基因cDNA序列，构建其真核表达载体，再通过体外转录翻译的方法在体外获得CDH22蛋白的表达。然后构建PRL-3的原核表达载体pGEX-4T-1-PRL-3，通过诱导表达，纯化，获得带有GST标签的PRL-3融合蛋白。运用GST-pull down技术在体外对PRL-3与CDH22的相互作用进行验证。(2)免疫共沉淀(Clo-Immunoprecipitation，Co-IP)体内相互作用的验证分别从外源性和内源性两个角度进行免疫共沉淀。分别构建带有FLAG和HA蛋白表位标签的PRL-3和CDH22的真核表达载体，两种载体共转染HEK293A细胞，通过琼脂糖微珠Anti-HA Affinity Gel和Anti-FLAG M2 Affinity Gel分别进行免疫复合物共沉淀，再以抗HA和抗FLAG的抗体行Western blot检测，确定外源性的PRL-3和CDH22是否存在相互作用分别以抗PRL-3和抗CDH22抗体对结直肠癌细胞株中内源性PRL-3和CDH22蛋白的相互作用进行免疫共沉淀分析，确定内源性的PRL-3和CDH22蛋白是否存在相互作用。(3)共定位分析构建真核表达载体pEGFP-PRL-3，然后与pcDNA3-HA-CDH22共转染结直肠癌细胞株SW480细胞，另将pcDNA3-FLAG-PRL-3和pcDNA3-HA-CDH22共转染HEK293细胞。转染24h后，前者利用抗HA抗体进行免疫荧光检测，后者利用不同种属来源的抗FLAG和抗HA抗体进行免疫荧光双标记，分别在激光共聚焦显微镜下观察外源性的PRL-3和CDH22在不同细胞体内是否存在共定位现象。运用免疫荧光双标记方法对结直肠癌细胞内的PRL-3和CDH22蛋白进行共定位分析，确定内源性的两种蛋白是否存在共定位情况。(4)CDH22的生物信息学分析利用在线分析软件和数据库对CDH22蛋白的结构特点、表达特征及其可能的相互作用蛋白网络进行生物信息学的初步分析预测。4、结直肠肿瘤组织中CDH22的表达检测及其临床意义分析应用免疫组化和荧光定量PCR技术从蛋白和mRNA水平检测CDH22在结直肠正常粘膜、结直肠腺瘤、结直肠癌及淋巴结转移癌中的表达，初步探讨CDH22与结直肠癌发生发展的关系。5、CDH22表达沉默对结直肠癌细胞生物学特性的影响利用在线数据库和设计软件设计四个CDH22干扰片段，构建含U6启动子的慢病毒载体，将慢病毒载体质粒与辅助质粒共转染293FT细胞包装慢病毒，收集病毒上清，进行病毒滴度测定。用含CDH22特异性干扰片段的慢病毒感染SW480／EGFP~+细胞，以含无关序列载体的病毒为阴性对照。杀稻瘟菌素筛选，挑取抗性单克隆，荧光定量PCR和Western blot检测各干扰克隆细胞中CDH22基因干扰效率，以干扰效率最高的克隆为下一步实验的研究对象。利用MTT法、平板克隆形成实验及流式细胞术检测CDH22沉默后对细胞体外增殖的影响；利用体外侵袭小室(boyden小室)进行体外侵袭实验，检测CDH22沉默后对结直肠癌侵袭能力的影响；在裸鼠体内观察CDH22沉默后对结直肠癌细胞致瘤能力的影响。结果1、结直肠癌组织中PRL-3的表达及临床意义免疫组化结果表明在结直肠癌组织中，伴发区域淋巴结转移的癌组织比未伴发转移的癌组织PRL-3的表达明显增强，差异具有显著性(Z=-2.083，P＜0.05)。而PRL-3蛋白在淋巴结转移癌中的表达明显高于相应原发癌，差异具有显著性(χ~2=4.730，P=0.030)。PRL-3蛋白表达与侵袭程度也有关，侵袭程度深的结直肠癌组织中PRL-3的表达增强(P＜0.05)，PRL-3蛋白的表达与组织类型及分化程度则无关系(P＞0.05)。荧光定量PCR检测结果发现PRL-3 mRNA的表达与结直肠癌转移及侵袭程度密切相关，结果与蛋白水平的检测具有一致性，即侵袭程度深的癌组织表达程度高(t=5.423，P＜0.001)，伴发转移的结直肠癌组织中PRL-3的表达明显高于未发生转移的结直肠癌组织的表达(t=-3.134，P＜0.05)，PRL-3 mRNA的表达与癌组织的分化程度无相关性(P＞0.05)。研究结果提示PRL-3的表达与结直肠癌侵袭、转移高度相关，即PRL-3表达强者侵袭能力强，转移发生率高，而表达弱或阴性者侵袭能力弱，转移的发生率低。2、PRL-3相互作用蛋白的筛选(1)PRL-3相互作用蛋白的生物信息学分析利用在线数据库，发现人PRL-3(hPRL-3)与果蝇PRL(dPRL-1)接近，进而发现果蝇dPRL-1蛋白是CG11678-1A和CG17819-PA两蛋白间的重要桥梁。应用保守的蛋白间相互作用(interologs)方法，结合虚拟Northern杂交分析方法，初步预测人ARP6(actin-related protein 6 homolog)及ADP-ribosylation factor-like protein家族成员ARL-3为PRL-3相互作用蛋白。(2)酵母双杂交筛选PRL-3相互作用蛋白以PRL-3蛋白为“诱饵蛋白”，筛选人胎脑cDNA文库，共获得四个与PRL-3诱饵蛋白相互作用的阳性克隆，其中两个克隆经过测序证实均为钙粘蛋白家族成员CDH22。3、PRL-3相互作用蛋白的鉴定(1)GST-pull down通过GST-pull down实验，在体外验证PRL-3与CDH22的相互作用，结果发现GST-PRL-3融合蛋白可以与CDH22结合，而对照GST蛋白未观察到能与CDH22蛋白结合，实验结果证实PRL-3蛋白与CDH22蛋白在体外存在相互作用关系。(2)免疫共沉淀外源性的免疫共沉淀结果显示Anti-HA Affinity Gel沉淀HA-CDH22蛋白的同时，FLAG-PRL-3也～同被沉淀。而用Anti-FLAG M2 Affinity Gel沉淀FLAGPRL-3蛋白的同时，外源蛋白HA-CDH22也一同被沉淀，实验说明外源性的CDH22和PRL-3在体内环境中存在相互作用关系。内源性的免疫共沉淀结果显示在PRL-3抗体在沉淀PRL-3的同时，CDH22蛋白一同被沉淀；而抗CDH22抗体在沉淀CDH22的同时，PRL-3蛋白也一同被沉淀，实验结果证实内源性的CDH22和PRL-3在体内环境中同样存在相互作用关系。(3)共定位分析无论是共转染外源性PRL-3和CDH22的表达还是内源性PRL-3和CDH22的表达，激光共聚焦显微镜下观察到的实验结果都证实PRL-3与CDH22两种蛋白在细胞内确切存在相互作用。酵母双杂交的初步筛选和各种验证方法的实验结果最终明确证实PRL-3蛋白与CDH22蛋白之间存在直接相互作用。(4)CDH22的生物信息学研究根据CDH22的序列特征，初步证实CDH22蛋白的结构具有Cadherin家族保守的5个重复胞外蛋白结构域CA。虚拟Northern杂交的结果发现CDH22在众多结直肠癌细胞系中都有表达。利用生物信息学对CDH22相互作用蛋白的初步分析发现WNT通路中的重要组成部分Wnt1蛋白可能与CDH22存在相互作用关系。4、结直肠癌组织中CDH22的表达及临床意义免疫组化结果显示，CDH22表达主要定位在细胞胞浆内。CDH22在正常结直肠粘膜、腺瘤、癌及淋巴结转移癌组织中的表达明显不同，差异具有显著性(χ~2=2.672，P＜0.01)。CDH22蛋白的表达与结直肠癌的侵袭转移密切相关，CDH22表达弱或阴性者侵袭能力弱，转移的发生率低；而表达强者侵袭能力强，转移发生率高。荧光定量PCR的检测结果发现PRL-3 mRNA的表达水平与结直肠癌转移及浸润程度密切相关，结果与蛋白水平的检测结果具有一致性。5、CDH22表达沉默对结直肠癌细胞生物学特性的影响(1)利用RNAi技术建立CDH22基因稳定沉默的结直肠癌细胞株构建了四个CDH22的慢病毒干扰载体，包装慢病毒后，含有干扰载体的慢病毒感染SW480／EGFP~+细胞，杀稻瘟菌素筛选抗性克隆，约14天后，挑取建立抗性单克隆，利用荧光定量PCR和Western blot技术检测各克隆的CDH22的表达情况，筛选干扰效率最高的克隆(85.4％)为下一步实验的研究对象。(2)CDH22基因表达沉默对结直肠癌细胞生物学特性的影响MTT法观察CDH22基因表达沉默后体外细胞的增殖情况，与SW480／EGFP~+／mock和SW480／EGFP~+细胞相比，SW480／EGFP~+／CDH22~-细胞的增殖速度明显减慢，并且呈时间依赖关系(F=5.633，P＜0.001)。平板克隆形成实验显示SW480／EGFP~+／CDH22~-细胞的活力显著下降(F=72.337，P=0.003)。利用流式细胞术检测各组细胞的细胞周期的结果显示SW480／EGFP~+／CDH22~-细胞S期比率减少，表明CDH22表达沉默后细胞增殖缓慢。综合结果表明CDH22表达水平减低后，肿瘤细胞体外生长被显著抑制。体外侵袭小室实验检测CDH22基因表达沉默后细胞侵袭能力的改变，结果显示，与SW480／EGFP~+／mock和SW480／EGFP~+细胞相比，SW480／EGFP~+／CDH22~+细胞的侵袭能力明显降低(F=51.083，P＜0.001)，说明CDH22表达沉默抑制了结直肠癌细胞的体外侵袭能力。将CDH22基因表达沉默结直肠癌细胞和对照细胞接种于裸鼠的皮下，通过30天连续的观察，我们发现CDH22基因表达沉默后，显著性地抑制了结直肠癌细胞的体内增殖能力，增殖差异从第20天开始，到第30天，差异达到1.4倍。结论1、PRL-3与结直肠癌侵袭转移密切相关；2、CDH22蛋白与PRL-3蛋白在体内存在直接相互作用，PRL-3-CDH22相关信号途径参与结直肠癌转移的发生；3、CDH22与结直肠癌发生发展密切相关，是促进结直肠癌增殖、侵袭、转移的重要基因。本研究的创新之处1、利用酵母双杂交系统结合基于蛋白质水平的GST-pull down、免疫共沉淀和共定位等分析方法，筛选并鉴定出结直肠癌转移相关基因PRL-3的新型相互作用蛋白CDH22，提出PRL-3-CDH22相关信号途径参与结直肠癌转移的发生的设想，为研究结直肠癌转移的信号通路机制提供新的思路；2、利用慢病毒载体和RNAi技术建立了稳定的CDH22基因表达沉默的结直肠癌细胞株，为进一步阐明PRL-3-CDH22相关信号途径调节结直肠癌转移的机制提供新的实验手段；3、初步证实CDH22与结直肠癌侵袭转移密切相关。