单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)分为Ⅰ型(HSV-1)和Ⅱ型(HSV-2)两个血清型，无论是发展中国家还是发达国家，HSV的自然感染率都相当高。Ⅰ型感染与单纯疱疹病毒性脑炎(herpes simplex encephalitis，HSE)有关，且病势凶险，预后较差；而Ⅱ型感染与生殖道炎症及胎儿畸形有关。两型感染早期抗病毒治疗均有效，因此需要建立HSV感染的一种早期、快速、敏感和特异的诊断方法。目前实验室确定HSV感染的主要方法是免疫学检测，其中型特异性IgM抗体的检测可用于HSV急性感染的早期诊断。病毒糖蛋白G是抗HSV体液免疫应答的主要靶位，可作为HSV型特异性血清学诊断(抗体检测)的标准抗原。因此，为了建立一种敏感、特异、快速的HSV血清学检测方法，我们进行了如下研究工作： 第一部分：Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白G重组基因片段的克隆及其在细菌中的高效表达 通过生物软件分析Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白G的氨基酸序列，筛选出HSV1-gG蛋白中优势抗原决定簇，采用PCR技术扩增含强抗原决定簇较集中的基因片段。PCR产物纯化后用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，电泳回收后与用上述双酶切割并电泳回收的pGEX-4T-2质粒连接，获得的重组质粒转化大肠杆菌TG1感受态细胞。PCR鉴定可扩增出与目的片段大小一致的DNA片段。同时提取重组质粒进行DNA序列测定与比对分析，结果证实DNA插入序列正确。 对构建的重组工程菌用IPTG进行诱导表达，SDS-PAG正电泳分析显示HSV1-gG特异性表达产物的分子量约为43.5kD，表达量占菌体蛋白的30％左右。 本研究成功构建了高效表达Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白G基因的工程菌，为获得抗原性强、特异性好的HSV-1蛋白抗原奠定了基础。 南京医科大学硕士学位论文 第H部分：I型单纯疮疹病毒糖蛋白G 重组表达蛋白的纯化与初步鉴定 将表达量较高的 HSV飞G鹰ST重组工程菌大量培养后加 IPTG诱导表达，离心收菌并超声破碎后进行SDS－PAGE电泳检测，证实表达蛋白是以可溶性形式存在。将超声破菌离心的上清用硫酸铰分级沉淀后分别取上清与沉淀用SDS－PAGE电泳检测，证实表达蛋白在40％与50％饱和度的硫酸锭溶液中沉淀析出，得到浓缩及部分纯化。将这两种沉淀合并溶解、透析后上DEAE七epharose FF阴离子交换柱，用不同浓度的NaCI洗脱液分段洗脱，SDS－PAGE电泳检测。收集含有融合表达蛋白的洗脱峰门00mmol／L NaCI），透析后再上DEAE－Sepharose FF阴离子交换柱，用不同浓度的NaCI洗脱液进一步分梯度洗脱；收集含有表达蛋白的洗脱峰门 NaCI），V除去大部分杂蛋白，获得的融合表达蛋白纯度约达90％。 将纯化获得的 HSV飞G／GST融合表达蛋白作抗原，稀释后包被酶联反应板；ELISA间接法检测已知的抗mV刁 阳性血清、抗HSVl 阳性血清与正常人血清，结果显示此表达蛋白能分别与抗HSVd 阳性血清、抗HSV刁 阳性血清反应，而不与正常人血清反应。同时Western blot分析也证实此蛋白抗原能与阳性血清抗体发生特异性结合。以上结果初步说明该融合表达蛋白制备、纯化较容易，且具有较强的抗原表位，与正常人血清亦来出现非特异性反应。 本研究建立了表达蛋白的纯化方法，并纯化获得了具有良好抗原性的gG＜蛋白抗原。 第三部分：HSV习抗体检测试剂的初步研制与应用 将纯化后的重组表达蛋白 HSV lgG／GST作为抗原包被酶联反应板，待测血清标本为一抗，辣根过氧化物酶标记的抗人 IgG、抗人 IgM抗体为H抗，ELISA问接法分别检测46份l刁诊随机血清、20份抗HSV习 阳性血清与 sl份正常人阴性血清。结果重组蛋白与 720的门诊随机血清门gG）及20份抗HSV＊ 阳性血清门gM）均可发生特异反应，而与 sl份阴性血清门咖）则不起朋。以上结 2 甫京医科大学硕士学位论文果说明该融合表达蛋白有较好的抗原性和特异性。 本研究建立了以 ELISA间接法为驹6bHSV－l抗体检测方法，并对检测试剂、反应条件进行了优化，初步研制了敏感性高、特异性强的＊S＊l抗体检测试剂。 第四部分：11型单纯疙疹病毒糖蛋白G的 抗原表位分析及其基因克隆 通过生物软件筛选出11型单纯疤疹病毒糖蛋白G中优势抗原决定簇，用PCR枝术扩增含强抗原决定簇较集中的基因片段，将克隆白基因片段插入质粒表达载体 pGEX－4T2、pET28a（）、pQE－30、pMAL七 与pMAL下 内，获得的重组质粒转化大肠杆菌TGI或BLZI （DE）。通过酶切鉴定和 DM序列测定、比对分析，证实 DM插入序列正确。分析了选择的吵《基因片段在多个载体系统内不表达的原因，为改构其高表达工程菌提供了依据。