旋毛虫病(Trichinellosis)是一种较为严重的人兽共患寄生虫病,主要因宿主生食或半生食了含有旋毛虫幼虫囊包的肉类引起。该病地理分布广泛,在过去的两个世纪里,全球许多地区有旋毛虫病暴发流行的报道,被称为再度肆虐的感染性疾病。旋毛虫是组织内寄生线虫,目前主要采用传统病原学诊断方法,但肌肉活检及尸体膈肌压片镜检的相关调查数据较少,对各地人群旋毛虫病患病率的评估很困难。血清学检查虽然可行,但有诸多不足,如价格较贵、抗体检测存在窗口期、与其他寄生虫病易发生交叉反应等,往往需要做更昂贵的免疫印迹实验。目前核酸分子检测技术的应用日趋广泛,随着检测成本的降低,检测过程更加标准化和自动化,此类技术将越来越多地应用于寄生虫病的早期诊断、现场快速检测及流行病学调查等各个方面。环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification,简称LAMP),是日本学者Notomi发明的一种体外核酸等温扩增技术,这种技术需要特殊设计的4~6条引物来特异性识别目标片段,在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下在很短的时间内扩增靶序列,同时产生副产物焦磷酸镁,可通过浊度的变化来直接判断阴阳性结果。因此具有特异、快速、高效、简便的特点。本论文将LAMP技术应用于旋毛虫感染小鼠不同组织样本中旋毛虫DNA的快速检测,研发了旋毛虫LAMP快速检测试剂盒,使其更适宜于现场和基层医疗单位的旋毛虫快速检测。以前的研究表明,PCR法检测血液中旋毛虫DNA具有一定的早期诊断价值。而本研究过程中通过建立高、中、低3种不同剂量旋毛虫感染小鼠模型,收集感染早期阶段的肌肉、血液、粪便样本进行LAMP检测,验证了该方法的高度敏感性和特异性,特别是对于肌肉中幼虫密度非常低时,该技术更突显其重要的检测和诊断价值。本论文研究证明LAMP法比PCR法更敏感、快速、简便,有望在提高人及动物旋毛虫病的早期诊断,旋毛虫病的现场检测、肉类检疫及流行病学调查等领域发挥更大作用。材料和方法1旋毛虫虫种、实验动物、基因组DNA的提取本实验所用的虫种,旋毛虫河南猪源株(Trichinella spiralis,T1),北方旋毛虫(T.nativa,T2)、伪旋毛虫(T.pseudospiralis,T4)、南方旋毛虫(纳氏旋毛虫,T.nelsoni,T7),来自国际旋毛虫参考中心(International Trichinella Reference Centre,ITRC)本实验室昆明小鼠传代保种。其他人体寄生蠕虫标本,包括似蚓蛔线虫、蛲虫、鞭虫、十二指肠钩口线虫、华支睾吸虫、布氏姜片虫、日本血虫、猪带绦虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫,均由本实验室保存。6w龄健康雄性昆明小鼠(SPF级),体重20g~25g,购买并饲养于军事医学科学院实验动物中心。旋毛虫及其他样本基因组DNA的提取采用天根公司的血液/组织/粪便基因组DNA提取试剂盒。2 LAMP引物设计及最佳引物筛选靶基因为NCBI Gen Bank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上公开的旋毛虫1.6kb重复DNA序列(Gen Bank:X06625.1),将其Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)特异性比对。选用Primer Explorer V4设计软件(EIKEN CHEMICAL CO.,LTD,Tochigi,Japan)设计引物(http://primerexplorer.jp/e/),共设计出16套引物,以旋毛虫的基因组DNA为模板,在相同的条件下进行LAMP扩增,筛选最佳引物。3 LAMP法检测旋毛虫特异性评价以旋毛虫(T1)、乡土旋毛虫(T2)、伪旋毛虫(T4)、纳氏旋毛虫(T7)基因组DNA作为阳性对照,双蒸水为阴性对照,其他10种人体寄生虫(似蚓蛔线虫、鞭虫、蛲虫、十二指肠钩口线虫、布氏姜片虫、华支睾吸虫、日本血吸虫、猪带绦虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫)的基因组DNA为特异性对照进行LAMP反应,用实时浊度仪和钙黄绿素颜色反应两种方法检测结果。4 LAMP法检测旋毛虫核酸浓度的敏感性及与PCR法的比较为验证筛选出的最佳引物的敏感性,并与PCR法的敏感性相比较,提取100条旋毛虫肌肉幼虫基因组DNA,经核酸定量后以10倍梯度进行稀释,DNA的浓度范围为3,620 ng/μl至3.62 fg/μl,每个LAMP反应中加入2μl的DNA模板,LAMP法进行敏感性评价。同时以TS2F3和TS2B3为引物,以相同浓度的旋毛虫DNA为模板,PCR法进行敏感性评价。5 LAMP法检测单条旋毛虫幼虫的敏感性及与PCR法的比较提取10条旋毛虫肌幼虫基因组DNA,定容于1ml的PBS溶液中,以10倍梯度稀释,使浓度范围相当于每1ml PBS溶液中含10~0.00001条幼虫DNA,每个LAMP反应中加入2μl的DNA模板。用LAMP法和PCR法进行敏感性评价。6旋毛虫不同模拟样本核酸提取方法的比较评价DNA提取试剂盒和Chelex法提取旋毛虫肌肉、血液、粪便模拟样本基因组DNA的效果。分别将1条旋毛虫肌幼虫加入50μl健康小鼠血液,200mg健康小鼠粪便,250mg健康小鼠肌肉组织,分别用天根公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒和Chelex裂解液提取基因组DNA进行LAMP检测,评价两种方法提取的单条旋毛虫DNA模板的扩增效率。7评价封闭剂对LAMP反应和钙黄绿素显色效果的影响检测封闭剂是否影响LAMP反应及钙黄绿素的显色效果,将熔点为42℃的精炼固态石蜡融化后导入模具,制成直径与反应管相同的柱状固态石蜡块,设计6组对照实验比较添加或不添加石蜡及钙黄绿素对LAMP反应的影响。8 LAMP试剂盒检测小鼠肌肉中旋毛虫DNA(1)将10条旋毛虫肌幼虫加入1g健康小鼠肌肉组织,充分研磨后提取基因组DNA,以10倍梯度进行稀释,使浓度范围相当于每1g肌肉组织中含10~0.00001条幼虫,每个反应加入2μl的DNA模板,用LAMP法和PCR法评价肌肉模拟样本的敏感性。(2)6w龄健康雄性昆明小鼠18只,随机分成3组,每组6只,用灌胃法感染旋毛虫。组Ⅰ:阴性对照组;组Ⅱ:每只小鼠感染10条肌幼虫;组Ⅲ:每只小鼠感染50条肌幼虫;LAMP法检测感染后第20d的小鼠肌肉样本。9 LAMP试剂盒检测小鼠血液中旋毛虫DNA6w龄健康雄性昆明小鼠15只,随机分成3组,每组5只,用灌胃法感染旋毛虫。每组小鼠分别感染10条、100条、300条肌肉幼虫,建立低、中、高度感染小鼠动物模型。感染后第1d~20d每天采集每只小鼠尾静脉血50μl,每天5个血液样本,共300个样本提取基因组DNA进行LAMP检测。10 LAMP试剂盒检测小鼠粪便中旋毛虫DNA6w龄健康雄性昆明小鼠15只,随机分成3组,每组5只,用灌胃法感染旋毛虫。每组小鼠分别感染10条、100条、300条肌幼虫,感染后第1d~20d每组小鼠每天采集粪便样本,分成4份样本,共240个样本提取基因组DNA进行LAMP检测。11统计分析使用软件SPSS 17.0对血液、粪便样本的LAMP检测数据进行卡方检验统计分析,检验水平为α=0.05。结果1最佳引物筛选通过对靶序列Blast比对,旋毛虫1.6kb DNA重复序列具有很好的特异性,根据该序列共设计了16套引物,在相同的条件下进行LAMP扩增,15套可以扩增出靶基因,尤其添加了环引物后扩增效率提高了1/3,其中TS2套引物最先发生LAMP反应,且扩增效率最高,作为最佳引物进行下一步的实验。2特异性实验只有阳性对照组旋毛虫(T1)、乡土旋毛虫(T2)、伪旋毛虫(T4)、纳氏旋毛虫(T7)的基因组DNA作为模板时发生LAMP扩增,而阴性对照组其他10余种人体寄生蠕虫的基因组DNA和水作为模板时均没有发生扩增。实时浊度仪和钙黄绿素颜色反应两种方法检测结果一致,实验说明TS2套引物具有很好的属特异性。3 LAMP法检测旋毛虫核酸浓度的敏感性及与PCR法的比较LAMP法可检测到DNA的最低浓度为362 fg/μl,以TS2F3和TS2B3为引物,PCR反应产物是225bp大小的扩增条带,经测序为目的片段。PCR法检测到的最低浓度为3.62 pg/μl,因此LAMP法比PCR法的敏感性高出10倍以上。4 LAMP法检测单条旋毛虫的敏感性及与PCR法的比较LAMP法检测单条旋毛虫肌幼虫的灵敏性为0.001条/ml,PCR法的灵敏性为0.01条/ml,验证了LAMP法比PCR法敏感性高出10倍以上结论。5旋毛虫样本不同核酸提取方法的比较用天根公司的血液/组织/粪便基因组DNA提取试剂盒和Chelex裂解液提取含1条幼虫的血液、粪便、肌肉模拟样本DNA,经LAMP检测均为阳性,两种方法提取的DNA模板的扩增效率差异不显著。6评价封闭剂的影响加封闭剂组与不加封闭剂组的LAMP检出时间不变,显示封闭剂不抑制LAMP扩增效率;加钙黄绿素组的封闭剂对LAMP检出时间不变,显示封闭剂不抑制添加了钙黄绿素的LAMP扩增效率。7 LAMP试剂盒检测小鼠肌肉中旋毛虫DNA(1)LAMP法检测每克肌肉组织含10条幼虫的DNA,最低可检测到0.01条/g,PCR法为0.1条/g,可见LAMP法比PCR法的敏感性高出10倍以上。(2)分别感染10条、50条肌幼虫组第20d的小鼠肌肉样本,2组LAMP检测均为阳性结果,检出率为100%(6/6),未感染组小鼠肌肉样本均为阴性结果。8 LAMP试剂盒检测小鼠血液中旋毛虫DNA(1)为LAMP检测小鼠轻度感染(10条幼虫)组1d~20dpi的血液样本,每天5份样本,共100份样本,最早于第9dpi的样本中检测到旋毛虫特异DNA,第9d、10d、13d、18d~20dpi每天的阳性率为20%(1/5);第15d、17dpi每天的阳性率为40%(2/5)。(2)LAMP检测小鼠中度感染(100条幼虫)组1d~20dpi的血液样本,每天5份样本,共100份样本,最早于第1dpi的样本中检测到旋毛虫特异DNA,第1d、3d、11d、12d、15dpi每天的阳性率为20%(1/5);第7d、8d、10d、17d、19d、20dpi每天的阳性率为40%(2/5)。(3)LAMP检测小鼠重度感染(300条幼虫)组1d~20dpi的血液样本,每天5份样本,共100份样本,最早于第3dpi的样本中检测到旋毛虫特异DNA,第4d、5d、9d、13d、14d、16d、20dpi每天的阳性率为20%(1/5),第3dpi的阳性率为40%(2/5),第8d、10d、11d、19dpi的阳性率为60%(3/5),第15dpi的阳性率为80%(4/5)。(4)3组不同感染度小鼠LAMP阳性率间的差异没有统计学意义(c(17)=4.899,P=0.086),LAMP检测血液样本的阳性率与感染程度没有相关性。轻度感染小鼠不同天数间的LAMP检测阳性率差异无统计学意义(c(17)=20.000,P=0.395);中度感染小鼠不同天数间的LAMP阳性率差异无统计学意义(c(17)=23.459,P=0.218);高度感染小鼠不同天数间的LAMP阳性率差异有统计学意义(c(17)=31.393,P=0.037)。当轻度感染时LAMP检测阳性率与检测时间没有相关性,当重度感染时LAMP检测阳性率与检测时间有一定的相关性,第8d~15dpi检出率较高。9 LAMP试剂盒检测小鼠粪便中旋毛虫DNA(1)LAMP检测小鼠轻度感染组(10条幼虫)第1d~20dpi的粪便样本,每天4个样本,共80份样本,最早于第6dpi的样本中检测到旋毛虫特异DNA,分别在第6~11d、13~19dpi的粪便样本中检测出阳性样本;其中第6~10d、13~15d、17dpi每天的阳性率为25%(1/4),第11d、18d、19dpi每天的阳性率为50%(2/4)。(2)LAMP检测小鼠中度感染(100条幼虫)组1d~20dpi的粪便样本,每天4个样本,共80个样本,最早于第2dpi的样本中检测到旋毛虫特异DNA,分别在第2、4、5、7d、9~20dpi的粪便样本中检测出阳性样本;其中第2d、4d、9d、11d、19d、20dpi每天的阳性率为25%(1/4),第10d、14d、18dpi每天的阳性率为50%(2/4),第5d、7d、12d、13d、15~17dpi每天的阳性率为75%(3/4)。(3)LAMP检测小鼠重度感染(300条幼虫)组1d~20dpi的粪便样本,每天4个样本,共80个样本,最早于第2dpi的样本中检测到旋毛虫特异DNA,分别在第2~20dpi的粪便样本中检测出阳性样本;其中第2d、3d、6d、9d、18dpi每天的阳性率为25%(1/4),第5d、14d、19dpi每天的阳性率为50%(2/4),第4d、7d、8d、10d、13d、15d、16d、20dpi每天的阳性率为75%(3/4),第11d、12d、17dpi每天的阳性率为100%(4/4)。(4)3组小鼠LAMP阳性率间的差异具有统计学意义(c(17)=14.823,P=0.001),阳性率与感染剂量有相关性(rs=0.500,P<0.001),阳性率随感染剂量的增加而升高(F=20.492,P<0.001)。轻度感染组不同天数间的阳性率差异无统计学意义(c(17)=15.761,P=0.673);中度感染组不同天数间的阳性率差异无统计学意义(c(17)=27.389,P=0.096);重度感染组不同天数间的阳性率差异无统计学意义(c(17)=27.389,P=0.096)。可以看出LAMP检测粪便样本的阳性率与感染后检测时间没有相关性。结论1.本论文发明的旋毛虫LAMP快速检测试剂盒,可在60min内完成反应。具有良好的敏感性和特异性。有望应用于旋毛虫病的现场检测、肉类检疫及流行病学调查等领域。2.应用该试剂盒,对不同剂量旋毛虫感染小鼠早期阶段的肌肉、血液、粪便样本进行检测,可以在低剂量感染小鼠的早期各种来源的样本中检测到旋毛虫DNA,具有较高的检出率。3.LAMP试剂盒检测旋毛虫小鼠血液样本的阳性率与感染程度没有发现相关性。当轻度感染时阳性率与检测时间没有发现相关性,当重度感染时阳性率与检测时间有相关性,第8d~15dpi检出率较高。4.LAMP试剂盒检测旋毛虫小鼠粪便样本的阳性率与感染程度有相关性,阳性率随感染剂量的增加而升高,与感染后检测时间没有发现相关性。