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研究目的和意义:原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤,其中肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是全球第六位最常见的肝癌类型,其致死率高居肿瘤死亡的第二位[1]。中国每年新增肝癌数量约占全球的一半,严重威胁我国人民健康[2]。中国肝癌常发生在肝硬化基础上,约80%的病例与HBV或HCV感染有关。虽然有多种治疗手段,如手术、化疗、放疗、介入等手段,但由于肝癌发病隐匿,多数病人就诊时已处于晚期,伴有基础肝病,治疗有效率低,病人预后差[3]的特点。因此,深入了解我国肝癌发生发展的分子机制,寻找早期诊断及治疗的分子靶点,具有重要临床意义。随着基因组学的发展,人们发现真核细胞基因组中存在着大量的非编码基因,这些基因的转录产物是非编码RNA(noncoding RNA),它们不翻译成蛋白。长链非编码RNAs,即lncRNAs(long noncoding RNAs)是非编码RNA的一种,是长度超过200个核苷酸的非编码RNA分子的总称[4]。lncRNAs在真核生物内普遍被转录,保守性不均一[5]。现有研究表明lncRNAs在正常细胞的增殖、凋亡、迁移、自噬、干性维持和调节细胞周期等多个生理过程中发挥重要作用。lncRNAs表达和功能的异常可导致多种疾病,包括肿瘤。lncRNAs参与多种肿瘤发生发展的多个阶段,与肿瘤细胞的恶性表型,如异常增殖、抗凋亡、肿瘤侵袭转移、肿瘤耐药等均存在相关性。目前为止,lncRNAs在肿瘤中的表达、功能及机制仍不完全明确,需要进一步深入研究。本课题通过lncRNAs表达谱芯片,检测了43对肝癌组织及对应癌旁组织中lncRNAs的表达水平,筛选出在肝癌组织中异常低表达的长链非编码RNA TSG5,TSG5在肝癌中的异常表达提示其可能参与了肝癌的发生发展。我们进一步通过临床标本分析验证、细胞生物学实验、动物实验及其分子机制的研究,揭示TSG5在肝癌发生发展中的生物学功能及分子机制,以期为肝癌的诊断提供新的思路。研究方法:首先,针对新鲜采集的43对肝癌标本(癌/癌旁)进行RNA芯片检测(晶芯?人类lncRNA芯片V3.0)。根据生物信息学分析,我们发现了在肝癌组织中异常低表达的lncRNA-TSG5。然后采用定量实时聚合酶链反应(quantificational real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)对另外收集的16对肝癌及癌旁组织进行TSG5表达量验证,其检测结果与芯片结果一致。再次,通过cDNA末端快速克隆技术(Rapid Amplification of cDNA,RACE)鉴定TSG5的5’端和3’端序列,扩增TSG5的全长序列并和数据库进行对比,最终确定TSG5的全长序列。检测TSG5在肝癌细胞系中的表达,建立慢病毒体系下调或者上调TSG5的表达。通过一系列体外的细胞增殖、迁移和侵袭等生物学实验和体内的裸鼠皮下成瘤-肺转移动物模型,揭示TSG5的生物学功能。接着利用RNApulldown联合质谱分析、RNA免疫沉淀法(RNA Immunoprecipitation,RIP)以及生物信息学等技术,进一步分析TSG5发挥作用的分子机制。研究结果:1、根据肝癌及癌旁组织的晶芯?人类lncRNA芯片V3.0所得的结果,发现了在肝癌里表达水平显著下降的TSG5。设计TSG5特异性引物,通过qRT-PCR进一步验证了芯片的结果。接着扩大样本量,在另外16对肝癌和癌旁组织中通过qRT-PCR检测TSG5的表达,发现和癌旁相比,TSG5在12/16的肝癌组织里表达下降,和表达谱芯片结果一致。我们利用RACE技术确定TSG5的起始和终止序列,并成功扩增TSG5的全长。通过和数据库比对,发现TSG5全长序列5’端与数据库注释序列一致,3’端序列比注释序列少108bp(base pair)。全长887bp。通过软件预测及克隆片段分析,证实TSG5无蛋白编码能力。通过对肝癌细胞HepG2及HCC-LM3的细胞浆、细胞核分离联合qRT-PCR检测,发现TSG5主要定位在细胞核里。通过RNA原位杂交技术(RNAscope技术),进一步证实TSG5的核定位。2、建立慢病毒体系下调或上调TSG5的表达。在TSG5表达量较高的肝癌细胞系HepG2及HCC-LM3中,抑制TSG5的表达可显著增强细胞的克隆形成、迁移和侵袭能力。而在TSG5低表达的SMMU-7721细胞系中过表达TSG5可显著抑制上述效应。利用HCC-LM3皮下成瘤-肺转移动物模型,我们发现抑制TSG5的表达会促进肝癌细胞的皮下成瘤能力和远处肺部转移灶的形成。3、在HepG2及HCC-LM3中下调TSG5的表达,细胞出现典型的上皮-间质转化的形态,细胞间连接变少、紧密性降低,细胞呈现细长状态。通过qRT-PCR检测上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal–transition,EMT)指标,发现上皮细胞指标E-cadheren表达显著下降,间质指标N-cadherin、Fibronectin、slug和snail及调节EMT的关键转录因子ZEB1、IL17B、SOX4、Spock2和DUSP5表达显著升高。免疫印迹实验(Western Blot)在蛋白水平进一步确认上述结果。4、通过RNA-pull down联合质谱分析,鉴定TSG5的相互作用的蛋白:精氨酸-丝氨酸剪切因子1(serine and arginine rich splicing factor1,SRSF1/SF2/ASF)。通过RNA相关免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)实验和RNA纯化染色质分离(chromatin isolation by RNA purification,CHIRP)实验进一步确认两者的结合。在HepG2中通过下调SRSF1的表达,可逆转下调TSG5引起的细胞EMT进程。结论:通过对肝癌的lncRNA芯片结果的分析,筛选并鉴定在肝癌组织中异常低表达的长链非编码RNA TSG5。通过上调及下调TSG5的表达,体内及体外研究,结果发现TSG5负向调节肝癌细胞的增殖、EMT及转移能力。TSG5是通过与SRSF1的结合来发挥上述功能。本研究表明长链非编码RNA TSG5是肝癌中重要的转移抑制基因,为阐明肝癌转移的机制提供新的思路。