胃癌是严重威胁人类生命健康的消化道恶性肿瘤之一。截至2012年，全球范围内每年因胃癌死亡的病例超过72万例，其中中国因胃癌死亡的病例占全球近半数之多，疾病负担严重，是胃癌防治的重点国家。由于缺乏早期、特异、敏感的筛查和诊断指标，大部分胃癌患者在诊断时已处于晚期，缺乏有效的治疗手段，致使胃癌患者的预后不良，目前胃癌患者的5年生存率仅为25%。因此，加强胃癌预后相关的生物学标志物的功能研究和机制学探讨，筛选出胃癌临床治疗的分子靶标，对后续胃癌的个体化治疗具有极其深远的意义。　　近十年来，随着二代测序技术的兴起，人们对于恶性肿瘤有了全新的认识，其中，大量的测序研究已经初步鉴定了胃癌的一批显著突变基因（Significantly mutated genes，SMGs），这些基因表现出较高的突变率，其功能性突变或使抑癌基因（Tumor suppressor genes，TSGs）失活，或使癌基因过度激活，为解释胃癌的发生发展提供了关键的理论基础，其中一些癌基因已被应用于肿瘤的小分子靶向治疗，目前针对EGFR，PIK3CA和KRAS等的靶向药物已经处于胃癌治疗的临床试验阶段。但是，具有靶向治疗前景的癌基因突变在胃癌中发生的频率往往较低，大量患者并未携带这些关键突变，这现象提示除突变驱动基因以外，胃癌还存在其他待发现的驱动因素。　　随着肿瘤研究的进展，研究者发现表观驱动基因（Epi-driver genes）是另一类重要的肿瘤驱动因素。肿瘤发生发展的过程中通常伴随广泛的表观遗传学改变，能引起某些基因表达的异常。表观驱动基因是一类易受表观水平调控而在肿瘤组织中激活的关键基因，这类基因通常仅在肿瘤中异常表达，并不携带功能性突变。异常的表观遗传学改变通常发生在肿瘤形成的早期阶段，因此鉴定肿瘤内的表观驱动基因，不仅能使我们进一步认识到表观遗传对肿瘤发生发展的影响，而且有助于肿瘤的预后判断和靶向治疗。表观遗传涉及DNA修饰，组蛋白修饰，非编码RNA调控，染色质重塑，核小体定位等生物学进程，其中基因组调控区域的甲基化修饰是机体参与环境应答的关键调控方式之一。基因启动子区CpG岛甲基化在调控基因表达方面发挥了重要作用，是表观驱动基因在肿瘤中发生异常激活的重要方式之一。既往研究已经在胃癌人群中发现了一批受启动子去甲基化调控激活的表观驱动基因，为胃癌发生发展的表观遗传学机制提供了线索。但既往发现的这部分受启动子去甲基化调控激活的表观驱动基因只是冰山一角，且对此类基因的功能研究也尚不完善。因此，有必要依托高通量技术的发展和公共数据库的规范和完善，对此类基因进行更深入的研究。　　目的：癌/睾丸（Cancer/testis，CT）基因是一类具有肿瘤-睾丸特异表达模式的基因，其在肿瘤中的异位激活可参与肿瘤过程，甚至驱动肿瘤发生发展。CT基因异常激活驱动肿瘤发生发展的特性与表观驱动基因相符，是重要的肿瘤基因候选。近期，本课题组对一类CT基因进行了研究，发现其符合表观驱动基因的表达特征，是重要的表观驱动基因候选。在该工作中，本课题组基于CT基因的表达特点，综合多个公共数据库的信息，在19种肿瘤中对CT基因进行了鉴定和探索性分析，初步发现这类CT基因在部分肿瘤组织中可受表观水平调控激活，促进肿瘤发生发展，其中启动子去甲基化是这类基因在肿瘤中异常激活的一种重要机制。但受限于当时的胃癌组织样本量（＜100），前期研究中未系统筛选胃癌的CT基因。随着癌症基因组图谱计划（The Cancer Genome Atlas，TCGA）的不断扩大，目前该项目已积累了大量的胃癌转录组测序数据。因此，本研究试图在既往研究的基础上，整合TCGA胃癌相关多组学数据库，进行了胃癌CT基因的鉴定；并结合临床信息，进一步筛选出了和胃癌预后存在关联的重要CT基因LIN28B，探讨了其在胃癌中的表观激活机制。　　方法：在本次研究中，我们首先基于TCGA胃癌的转录组测序数据，对胃癌中符合表达特征的CT基因进行了系统筛选，共鉴定605个CT基因；以此为基础，我们进一步结合临床信息和甲基化芯片数据，探讨CT基因与胃癌患者预后的关联及其潜在的激活机制。以下是本次研究所采用的筛选策略及相应的分析方法：将表达数据正态转化后，采用t检验比较基因在胃癌组织和癌旁组织的差异表达；构建多因素Cox回归模型探索基因表达、启动子DNA甲基化与胃癌预后的关联；采用Spearman等级相关分析启动子DNA甲基化与基因表达的关联；采用错误发现率（False discovery rate，FDR）的方法对多重假设检验中错误率进行控制。　　对本研究数据筛选的结果进行功能验证。在胃癌细胞内对候选基因进行敲除或过表达，检测其对细胞增殖、迁移、侵袭等肿瘤表型的影响，并基于在线的功能注释系统——京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）初步探讨候选基因在胃癌发生发展中可能作用的生物学通路。然后，我们通过CRISPR/dCas9编辑技术在胃癌细胞内改变候选基因的启动子甲基化，并采用重亚硫酸盐限制性聚合酶链式反应（Bisulfite sequence PCR，BSP）和反转录定量聚合酶链式反应（Reverse transcription and quantitative real-time PCR，RT-qPCR）分别检测靶点的甲基化水平和基因表达水平，验证了启动子甲基化对候选基因的转录调控作用。　　结果：基于TCGA数据库的生物信息学筛选，我们在605个胃癌CT基因中筛选到10个与胃癌预后存在显著关联的促癌基因（P＜0.05，PFDR＜0.20），其中有3个基因(LIN28B，NUP210L和SPINLW1)的表达水平和启动子甲基化存在显著的负相关关系（P＜0.05，PFDR＜0.20），仅LIN28B启动子甲基化水平(cg17933583)与胃癌预后存在显著关联（P=0.020）。数据筛选的结果提示LIN28B是胃癌潜在的表观驱动基因。　　TCGA数据显示LIN28B在癌旁组织中几乎不表达，但在部分胃癌组织中存在显著激活的现象（P＜0.001）。在校正年龄、性别和临床分期后，我们发现LIN28B激活的胃癌患者其生存时间相比未激活的患者明显缩短（校正HR=2.13，95%可信区间：1.25-3.62，Log-rank P=0.005）。然后，我们通过细胞表型实验证实了LIN28B在胃癌中的促癌作用。研究发现，LIN28B敲除后，HGC27细胞的增殖，转移，侵袭和克隆形成能力都发生下降；而在胃癌细胞系中外源性导入LIN28B过表达质粒后，HGC27，BGC823，MGC803细胞的转移和侵袭能力显著增强。KEGG通路分析发现LIN28B在胃癌中可能参与调控PPAR信号通路、碱基切除修复，细胞周期和FoxO信号通路，促进肿瘤的发生发展。　　随后，通过进一步的生物信息学分析和功能实验，我们探讨了LIN28B的表观基因组学激活机制。TCGA数据显示LIN28B在胃癌组织中的转录表达水平与启动子甲基化（cg11044575，cg17119521，cg17933583，cg19702779）存在显著的负相关关系（Pcg11044575=7.4×10-4，Pcg17119521=2×10-3，Pcg17933583=5.8×10-4，Pcg19702779=0.014），而在校正年龄、性别和临床分期后，我们发现启动子低甲基化（cg17933583）的胃癌患者其生存时间相比高甲基化者显著缩短（校正HR=1.31，95%可信区间：1.04-1.65，Log-rank P=0.020）。之后，我们又通过体外实验验证了LIN28B启动子去甲基化对其表达的激活作用。在HGC27胃癌细胞株中，我们通过CRISPR/dCas9技术对LIN28B启动子（cg11044575，cg17119521，cg17933583，cg19702779所在区域）进行去甲基化修饰，然后采用BSP和RT-qPCR分别检测了目标区域的DNA甲基化水平和基因的mRNA表达水平，发现该区域的DNA甲基化水平下降后，LIN28B的mRNA表达水平升高，表明LIN28B启动子去甲基化对其表达具有转录激活作用　　结论：本次研究在前期工作的基础上，对胃癌的CT基因进行了系统筛选，鉴定了一个与胃癌患者预后存在关联的重要CT基因LIN28B，随后采用功能实验证实其具有重要的促癌作用，并证明其启动子甲基化改变是胃癌样本中LIN28B激活的重要机制。综上，我们发现了一个新的胃癌表观驱动基因，为胃癌的预后预测和个体化治疗提供了分子依据和理论基础；方法学上，我们提供了dCas9技术用于DNA甲基化机制研究的具体实例，对后续研究具有一定的参考价值。