顶体反应(Acrosome reaction, AR)是受精作用的重要过程,影响AR的因素也将在精卵顺利完成受精作用的过程中起直接作用；AR前和AR过程中的精子膜蛋白(Spermic membrane proteins, SMPs)及顶体反应释放蛋白(Proteins released during AR, PRAs)(包括蛋白水解酶)在维持精子形态结构、新陈代谢和生殖功能中发挥着重要作用,尤其与精卵识别、结合和融合等受精活动密切相关。本文以成熟雄性中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)为实验材料,提取、分离了AR前SMPs (Spermic membrane proteins before AR, SBAs)和AR第三阶段SMPs (Spermic membrane proteins during phase third of AR, SDAs)及PRAs (包括蛋白水解酶),并通过电泳比较分析其异同,从而推测它们对AR的影响；制备了这三类精子蛋白的抗血清；通过统计分析和光镜观察等手段研究了水化作用、精子悬液密度、胰酶、Ca2+、温度、贮存液成分、冷冻贮存时间等多种理化因素及以上三类精子蛋白的抗血清对精子AR的影响；并在此基础上总结了三种简易高效诱导AR的新方法,即冷冻法、胰酶-Ca2+法和抗血清法。首先,通过分级分离的方法,从中华绒螯蟹的精荚中分离到游离精子。然后分别研究了水化作用、精子悬液密度、胰酶、Ca2+、温度、低温贮存对精子AR的影响。结果显示,AR前精子存在从未发生水化作用到发生水化作用的阶段性过程；高密度精子悬液下所得精子全部发生AR但处于反应的第二阶段,无Ca2+人工海水(Calcium-free artificial sea water, Ca2+-FASW)中的低密度精子未发生反应,而人工海水(Artificial sea water, ASW)中的低密度精子有一些发生了反应,说明精子悬液密度明显影响AR；胰酶加Ca2+和低温可高效诱导精子发生AR且低温诱导不需要Ca2+, AR时间只与贮存时间有关。第二,用冷冻法诱导精子发生AR,分离提取了PRAs包括蛋白水解酶；经反复冻融和离心法制备了SBAs和SDAs。并通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native polyacrylamide gel electrophoresis, Native-PAGE)比较了AR释放的蛋白水解酶、AR前和AR过程中的精子内蛋白水解酶的异同。结果显示,AR前和AR过程中的精子蛋白及PRAs中先后出现12种活性蛋白水解酶,有些是AR前已具有的并一直保持着较高的活性或逐渐减少乃至消失,有些水解酶活性是AR过程中产生的并持续到反应结束或逐渐提高,尤其在PRAs中达到最高。又通过SDS(十二烷基磺酸钠)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)和Naive-PAGE比较了以上各种蛋白的电泳图谱,结果显示,SMPs在AR前后有一些变化,且PRAs中也有SMPs组分。第三,利用提取分离的SBAs和SDAs及PRAs免疫小鼠,制备抗血清。然后又利用双向扩散对抗血清的效价和特异性进行了检测。结果显示,SBAs和SDAs及PRAs的抗血清的效价分别为1：8、1：8和1：32,且都能与精巢、输精管和贮精囊等组织粗提液形成沉淀线,三类蛋白都存在于以上三种组织中,而不存在于雄性中华绒螯蟹的血清中。用这三类抗血清分别与精子共孵,发现SBAs抗血清能高效诱导精子发生AR并达到反应的第4阶段,且反应精子外形轮廓清晰,证明该法既可以作为AR的高效诱导方法,又可以作为观察AR精子形态的有效手段。从以上实验可以看出,AR前中华绒螯蟹精子存在水化作用阶段,机械性挤压和低温(或温差)是AR的重要诱因,Ca2+对AR的外部诱导物胰酶具有激活作用；Ca2+-FASW低密度(5×106个mL)机械匀浆法和胰酶法可获得高质量不反应精子,冷冻法、胰酶-Ca2+法和抗血清法可高效诱导AR；有多个实验证据表明中华绒螯蟹精子存在获能阶段。