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目的：本实验室在2003年从海洋生物沙蚕消化道中分离出嗜麦芽寡养单胞菌D2，该菌能够大量胞外分泌某蛋白酶(protease of S.maltophilia，SMP)，且纯度高；课题组前期研究已获得了其完整的编码基因(smp)，并分析发现其可能通过Ⅱ型分泌系统分泌。为了能够明确D2株SMP蛋白的分泌表达机制，为该菌的进一步开发与利用奠定基础，本课题组拟利用同源重组技术使外源基因替换D2菌中的amp基因，通过研究突变菌株分泌表达生物活性物质的情况，对D2株SMP蛋白表达机制和嗜麦芽寡养单胞菌Ⅱ型分泌系统的基因结构及功能进行分析。因此，本文旨在构建用于D2株smp基因敲除的重组自杀质粒pDS132NotI-A-tet-B；同时在上述过程中获得了D2株Ⅱ型分泌系统GSP基因簇GspF和GspE两个编码基因的完整序列并进行分析。
方法1.通过药敏试验(MicsroScan W/A-40全自动微生物鉴定及药敏分析系统检测和稀释法)检测嗜麦芽寡养单胞菌D2株的耐药性，以筛选同源重组实验方案中合适自杀质粒和筛选标记基因。2.根据smp基因序列和GenBank收录的K279a和R551株的高保守序列设计引物，通过基因移步法分别PCR扩增获得其上下游的基因序列。3.对在smp上游序列中发现的Ⅱ型分泌系统GSP基因簇GspF和GspE两个基因进行序列和生物信息学分析。4.根据获得的smp基因的上、下游基因序列设计引物，并引入合适的酶切位点，分别扩增获得同源臂A和B；同时依据Genbank上收录的pBR322的四环素抗性基因(tet)设计引物，扩增获得筛选标记tet的完整ORF基因片段；以上各引物设计时同时引入适当长度的互补序列，以用于SOE-PCR连接。5.SOE-PCR连接扩增同源臂A、基因tet和同源臂B，得到三段的嵌合基因序列A-tet-B。6.分别用NotI酶切自杀质粒pDS132NotI和pMD18T-A-tet-B，连接构建重组自杀质粒pDS132NotI-A-tet-B，并进行测序分析。
结果1.两种药敏试验方法检测显示D2株对氯霉素和四环素敏感，对多种抗生素耐药，故选择pDS132质粒(catr)和DH5αλpir株(cat-)为同源重组的载体系统，选择tet基因为同源重组的筛选标记。2。在D2株赃因5’拼接三段序列含有两个完整开放读码框架(ORF)，分别为1200bp GspF基因(GenBank收录号GU377212.1)和1434bpGspE基因(GenBank收录号HM151387)。在GenBank中BLAST分析发现，D2株与嗜麦芽寡养单胞菌R551-3株的GspF基因及氨基酸序列同源性分别为93％和98％；GspE基因及氨基酸序列同源性分别为92％和99％。3.酶切鉴定证实SOE-PCR产物A-tet-B与自杀质粒pDS132NotI成功连接，测序分析发现同源臂A序列与设计完全一致，筛选基因tet部分与GenBank收录质粒pBR322的四环素抗性基因(tet)完全一致，同源臂B片段与原序列只有5个碱基不同，保真性达98％。
结论检测出D2株敏感性抗生素氯霉素(MIC为25μ g/ml)、四环素(MIC为12.5μg/ml)；克隆出嗜麦芽寡养单胞菌D2株Ⅱ型分泌系统基因簇中的GspF和GspE完整编码序列；嗜麦芽寡养单胞菌GspF和GspE种内高度保守，而对其他细菌差异显著，提示其Ⅱ型分泌机制可能与其他革兰阴性菌有一定差异。SOE-PCR连接扩增三段基因A-tet-B。构建了用于下一步基因敲除重组自杀质粒pDS132NotI-A-tet-B。