目的:肺癌依然是世界范围内癌性死亡最主要的原因,据网络数据库GLOBOCAN 2012的资料显示,在2012年,全球约有1.41千万新发癌症病例,820万患者死于癌症,其中56.8%的癌症患者以及64.9%的癌症死亡患者来自于欠发达国家。非小细胞肺癌约占全部肺癌的85%。虽然医疗技术在过去20年取得质的飞越,但是晚期非小细胞肺癌患者的预后依然很差,目前推荐的以铂类为基础的双药联合一线化疗方案有效率仅为20%,中位生存期为8-10个月,以铂类为基础的双药化疗方案联合贝伐单抗可使中位生存期轻微延长至12个月,以紫杉醇和培美曲塞为代表的二线化疗方案有效率仅为8%-9%,无疾病进展期少于3-5个月。吉非替尼和厄洛替尼是一种可逆的小分子ATP类似物,最初设计用于抑制野生型表皮生长因子酪氨酸激酶,随着临床研究的深入,Paez和Lynch等的研究证实,肿瘤细胞中EGFR基因突变与EGFR-TKIs的敏感性相关,对表达EGFR活化突变(21位外显子L858R突变和19位外显子E746-A750突变)的晚期非小细胞肺癌患者敏感性较高。随后EGFR基因突变即成为选择肺癌病人或预测EGFR-TKIs是否有效的重要指标。在西方人群中具有这些活化突变的肿瘤占非小细胞肺癌的10%-15%,而在亚洲人群为40%。遗憾的是,尽管第一代TKIs对拥有EGFR活化突变的患者拥有良好的初始治疗效果,但是大部分患者经过9-14个月的治疗后会进入疾病进展期。通过建立临床前模型和从疾病进展的患者身上获取肿瘤组织等方法,让我们获知了一系列导致EGFR-TKIs耐药的机制,基因和信号异常都会导致耐药的发生,例如HER2扩增、MET扩增、PIK3CA突变、BRAF突变、NF1缺失和潜在的FGFR信号传导。此外,耐药的肿瘤会有组织学的改变,例如转化为小细胞肺癌或者表皮间叶组织。然而更多的证据表明,发生于EGFR的二次突变进而导致第790位点苏氨酸转变为蛋氨酸(T790M)是最常见的耐药机制,这种改变在超过50%的耐药疾病进展期患者的肿瘤细胞中被检测到,T790M突变被认为是导致可逆性EGFR TKIs对受体抑制性减低的主要原因,它是通过空间位阻和增加ATP的亲和力来实现这个作用的。Filamin A(FLNa))亦称为肌动结合蛋白APB-280或Filamin-1,是由X染色体相关基因FLNA编码,人类FLNa是分子量为280KD的同源二聚体,形成一个V字形结构,在其N末端有一个肌动蛋白结合区(ABD),紧接着是由96个氨基酸组成的24个串联重复序列,第15、16个重复序列之间有一个铰链结构,第23、24个重复序列同样被一个铰链结构分开,末尾的65个氨基酸形成FLNa的二聚体结构,FLNa通过N-末端肌动蛋白结合区结合交联微丝形成有活性的三维立体结构,除了微丝蛋白,FLNa还与超过60多种细胞功能蛋白相互作用,包括跨膜受体、分子信号、DNA损伤修复蛋白。这些相互作用表明FLNa是多功能信号转导脚手架复合体的重要组成部分,参与细胞内信号转导和介导多种细胞活动,并在肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用,尤其在肿瘤的转移性和DNA损坏的敏感性,可以用于肿瘤的治疗和预后的评价。为验证FLNa的表达量是否影响非小细胞肺癌对EGFR-TKIs的敏感性,本研究拟从细胞和分子水平验证此项假设:(1)应用Western blot法对PC-9、H1975等NSCLC细胞株FLNa蛋白表达水平进行检测,筛选出高表达和低表达FLNa的肺癌细胞株。(2)构建p SIF1-FLNa sh RNA质粒,通过细胞稳定转染技术建立沉默FLNa的稳定细胞株。(3)分别应用MTS试验、划痕修复实验、侵袭试验(Transwell法)等实验方法检测吉非替尼对稳定细胞株的增殖、迁移和侵袭等生物学行为的变化。(4)Western blot法检测吉非替尼对稳定转染细胞EGFR、ERK、AKT等信号分子的磷酸化水平进行检测。研究结果将为临床选择TKIs药物提供新的生物标记物,为研发克服EGFR-TKIs耐药的新药提供新靶点。方法:1沉默FLNa表达稳定细胞株的建立将p SIF1-FLNa sh RNA质粒和对照质粒分别转染人肺腺癌细胞PC-9,48h后用嘌呤霉素筛选6周,挑选出稳定转染的单克隆细胞大量培养,得到沉默FLNa的稳定转染细胞株(PC-9/FLNa(KD))及其对照组细胞(PC-9/ctrl);利用Western blot检测稳定转染细胞株中FLNa蛋白的水平。2 MTS比色分析法检测吉非替尼对稳定转染细胞增殖能力的影响将PC-9/FLNa(KD)及PC-9/ctrl细胞分别接种于96孔板,次日换用含不同浓度吉非替尼(0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64μmol/L)的完全1640培养基继续培养48h,加入MTS试剂,通过测定各孔的吸光度(OD)值,计算细胞生长抑制率和吉非替尼的半数抑制浓度(IC50)。3划痕修复实验检测吉非替尼对稳定转染细胞株迁移能力的影响将PC-9/FLNa(KD)及PC-9/ctrl细胞分别接种于24孔板,待细胞贴壁生长达80-90%时,用10μl移液器吸头划痕,PBS洗去漂浮的细胞,两种细胞都分别于完全1640培养液及含浓度为0.08μmol/L吉非替尼的完全1640培养液中继续培养,在倒置显微镜下观察并拍照,每6h拍照一次,直至划痕愈合,测量划痕宽度变化,计算细胞迁移率。迁移率=(划痕初始宽度-目前宽度)/2/划痕初始宽度×100%)。4 Transwell法检测吉非替尼对稳定转染细胞侵袭能力的影响铺基质胶于Transwell小室的上室,将PC-9/FLNa(KD)及PC-9/ctrl细胞分别接种于上室,两种细胞都分别于无胎牛血清的1640培养液及含浓度为0.01μmol/L吉非替尼的无胎牛血清1640培养液中培养,下室放入含10%胎牛血清的1640培养液,继续培养24h后,95%冰乙醇固定,HE染色,显微镜下拍照,每个小室随机选取上、下、左、右及中心共5个视野,计算穿膜细胞数。5 Western blot检测吉非替尼对稳定转染细胞EGFR活化水平及其下游信号通路分子的影响将PC-9/FLNa(KD)及PC-9/ctrl细胞分别接种于35mm培养皿,予以浓度为0.01μmol/L吉非替尼进行药物干预,分别于0h、2h、4h、8h后,收集细胞,提取总蛋白,Western blot检测p Y-EGFR、EGFR、p-ERK、ERK、FLNa的蛋白水平,?-actin作为内参蛋白。结果:1稳定转染PC-9细胞中FLNa表达水平检测1.1稳定转染PC-9细胞FLNa蛋白水平的变化Western blot检测稳定转染细胞FLNa的蛋白水平,蛋白条带经灰度扫描定量及统计分析,PC-9/FLNa(KD)细胞FLNa蛋白的相对表达量(0.41±0.01)明显低于PC-9/ctrl细胞(0.77±0.01),有统计学意义(P<0.01)。2稳定转染PC-9细胞吉非替尼敏感性的变化2.1稳定转染PC-9细胞吉非替尼的IC50MTS法检测吉非替尼对稳定转染细胞的增殖能力的影响,结果显示:给予不同浓度吉非替尼作用的PC-9/FLNa(KD)细胞的生长抑制率均低于相应浓度的PC-9/ctrl细胞,差异有统计学意义(P<0.05);PC-9/FLNa(KD)组吉非替尼的IC50值(0.17±0.01)明显高于PC-9/ctrl组(0.08±0.00),差异有统计学意义(P<0.05)。表明PC-9/FLNa(KD)细胞对吉非替尼的敏感性低于PC-9/ctrl细胞。2.2稳定转染细胞迁移能力的变化及吉非替尼对其的影响划痕修复实验检测细胞迁移能力的结果显示:在无吉非替尼作用下,PC-9/FLNa(KD)组细胞6h、12h、18h的迁移率(17.45±0.13%,33.13±0.36%,50.00±0.00%)均明显高于PC-9/ctrl组(9.75±0.14%,19.63±0.20%,35.62±0.37%),均有统计学意义(均P<0.01);在0.01μmol/L吉非替尼作用下,PC-9/FLNa(KD)组细胞6h、12h、18h的迁移率(11.00±0.25%,27.64±0.47%,38.81±0.07%)明显高于PC-9/ctrl组细胞(6.89±0.17,13.97±0.18%,21.30±0.22%),均有统计学意义(P<0.01)。2.3稳定转染细胞侵袭能力的变化及吉非替尼对其的影响Transwell法检测细胞侵袭能力的结果显示:无吉非替尼作用的PC-9/FLNa(KD)组穿膜细胞数(147.00±0.58)明显多于PC-9/ctrl组(82.00±1.15),有统计学意义(P<0.01);在0.01μmol/L吉非替尼作用下,PC-9/FLNa(KD)组穿膜细胞数(64.00±0.58)明显多于PC-9/ctrl组细胞(7.00±1.15),有统计学意义(P<0.01)。3吉非替尼对稳定转染细胞EGFR活化水平及其下游信号通路分子的影响Western blot检测0.01μmol/L吉非替尼作用于稳定转染细胞0h、2h、4h、8h后各蛋白的表达水平,经灰度扫描,结果显示:0.01μmol/L吉非替尼作用0h、2h、4h、8h后,PC-9/FLNa(KD)组p-EGFR的水平(0.94±0.00,0.71±0.00,0.82±0.00,0.31±0.00)均明显高于PC-9/ctrl组(0.23±0.00,0.21±0.00,0.19±0.00,0.22±0.00),均有统计学意义(P<0.01);PC-9/FLNa(KD)组p-ERK的水平(0.98±0.00,0.36±0.00,0.35±0.00,0.46±0.00)均明显高于PC-9/ctrl组(0.74±0.00,0.23±0.00,0.06±0.00,0.16±0.00),均有统计学意义(P<0.01)。结论:1降低Filamin A的表达可促进PC-9细胞的增殖、迁移和侵袭;Filamin A通过调控PC-9细胞EGFR的活化(磷酸化)水平,影响MAPK/ERK激酶的活化,进而影响PC-9细胞的生物学行为。2 Filamin A通过抑制PC-9细胞EGFR及其下游MAPK/ERK信号转导通路激酶的活化,增加吉非替尼对PC-9细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用。